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《中南林业科技大学》 2007年
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梨新S基因的分离克隆及部分品种的S基因型、AFLP鉴定

杨谷良  
【摘要】:自交不亲和性是植物生殖过程的一种普遍现象,它作为防止近亲繁殖和物种退化的异花授粉机制,为物种的生存、发展以及种群的相对独立性提供了保障。梨是一种配子体自交不亲和性植物,其自交不亲和性主要是由S位点的等位基因所控制。在生产栽培中必须配置不同S基因型的授粉品种或通过人工授粉等措施来保证高产稳产。因此确定不同品种的S基因型将为授粉品种的配置及良种选育提供重要的科学依据。本文以冬黄等28个梨品种为实验材料,开展了品种S基因型的鉴定、新S基因的分离克隆等研究;另外,以爱甘水等30个梨为材料,采用AFLP标记技术,开展了不同品种指纹图谱和亲缘关系的相关研究。本论文主要研究结果如下: 1.梨不同品种S基因型的确定。采用PCR-RFLP、序列测定和亲缘关系分析等技术方法,确定了宝珠(S22S33)、冰糖(S19S31)、冬黄(S20S34)、黄梨(S22S34)、金秋(S3S9)、库尔勒(S22S34)、中梨一号(S4S35)、大果水晶(S3S9)、马蹄黄(S17S19)、懋功(S12S13)、柠檬黄(S31S32)、新雅(S4S17)、早酥(S22S35)、西子绿(S1S4)、黄花(S1S2)、黄金(S3S4)、清香(S4S7)、雪峰(S4S16)、雪芳(S4S16)、雪英(S3SX)、雪芬(S3SX)等品种的S基因型。 2.梨新S基因的分离鉴定。利用梨S基因扩增的"FTTYQ"和"anti-IIWPNV"特异引物组合,并经过克隆测序,从柠檬黄和冰糖梨中分离鉴定了梨S31-RNase新基因,该基因扩增片断大小为346bp,外显子和内含子的分别为201bp和145bp;从柠檬黄梨中分离鉴定了梨S32-RNase新基因,该扩增片断大小为999bp,外显子和内含子分别为213bp和786bp;从宝珠梨中分离鉴定了梨S33-RNase新基因,该基因扩增片断大小为532bp,外显子和内含子分别为195bp和337bp;从冬黄、库尔勒和黄梨中分离鉴定了梨S34-RNase新基因,该基因扩增片断大小为428bp,外显子和内含子分别为201bp和227bp;从早酥和中梨一号梨中分离鉴定了梨S35-RNase新基因,该基因扩增片断的大小为371bp,外显子和内含子分别为204bp和167bp。上述5个新基因在GenBank的登录号分别是:DQ072113、DQ072114、DQ082897、DQ224345和DQ224344。 3. S35-RNase基因的cDNA克隆与表达分析。以早酥梨的雌蕊为材料,提取总RNA,采用3'RACE和5'RACE技术,从早酥梨中扩增了一个S基因的cDNA全长。对该序列进行同源性比较,发现该序列为S35-RNase基因的cDNA全长序列。该序列全长681bp,编码227个氨基酸,具有日本梨S-RNase蛋白的序列特征:5个保守区和两个高变区、具有8个保守的半胱氨酸残基以及2个保守的组氨酸残基。该基因的cDNA序列登录到GenBank,登录号为DQ224344。采用Northern杂交技术,对该基因的表达情况进行了分析,结果发现该基因在大铃铛期表达量明显高于花前3d或花后3d,并且只在雌蕊中表达。 4.部分梨品种的AFLP分析。以爱甘水等30个梨品种为材料,利用AFLP技术进行研究,除八月酥和冀蜜两个梨品种没有特异谱带外,其它品种至少有一条以上的特异性条带,这些条带可以作为各品种进行分子鉴别的重要依据。通过聚类,发现所有品种聚为4个组:第一组主要是日本梨及与日本梨有亲缘关系的部分品种;第二组为中国砂梨品种;第三组只有2个品种:黄冠和清香梨,它们的一个共同亲本为新世纪;第四组是康德,其亲本中有一个是西洋梨,被单独聚为一类。从聚类结果看,不同的品种之间表现出了一定的地域相关性。
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