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《中南林业科技大学》 2011年
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里氏木霉的紫外诱变和高活性纤维素酶突变株的选育

覃玲灵  
【摘要】:以纤维素、半纤维素和木质素形式存在的生物质原料数量丰富,发展和利用生物质能源是实现经济、社会可持续发展的有效途径。在生物质原料转化利用方面,里氏木霉(Trichoderma reesei)是产纤维素酶的重要菌种之一,其生产的纤维素酶在能源、生物防治、食品等多个领域都得到了广泛的应用。本研究通过对里氏木霉进行紫外诱变,以筛选出高产纤维素酶的突变菌株,进一步提高其纤维素酶的产量,降低生产成本为目的。 本文基于筛选高产纤维素酶突变菌株的目的,对里氏木霉Rut C30进行紫外诱变,筛选突变菌株,并对其突变菌株的产酶条件进行优化,通过随机扩增多态性DNA (RAPD)对出发菌株和突变菌株的基因组进行分析。 对T.reesei Rut C30的孢子悬液进行紫外线诱变,确定最佳诱变时间为40s,该剂量下致死率为83.500%,正突变率为8.679%,以刚果红筛选培养基上水解圈与菌落直径的比值(H/d)为指标,进行初筛,再以液体发酵产酶进行复筛,最终获得了一株突变株A13,其滤纸酶活为4.328U/ml,相较于出发菌株2.786U/ml的酶活,提高了55.350%。对突变株A13进行6代连续培养,酶活稳定在4.160U/ml,其遗传稳定性较好。 通过碳源、复合氮源、产酶温度这三个单因素优化实验,获得了突变菌株A13产酶的最佳条件,以1.000%微晶纤维素为碳源、0.150%蛋白胨与0.050%硫酸铵为复合氮源,产酶温度为28℃的条件下,突变菌株A13的滤纸酶活为4.915U/ml,比优化前的4.160U/ml提高了18.150%。 在含有微晶纤维素的产酶培养基中添加适量的麦芽浸粉,实验表明,麦芽浸粉确实能促进里氏木霉的突变株产出更多的纤维素酶。当在1.000%微晶纤维素的基础上添加1.000%麦芽浸粉时,滤纸酶活提高到了5.720U/ml。采用中心复合实验设计,寻找微晶纤维素与麦芽浸粉的最佳配比。对中心复合实验设计的实验结果进行响应面分析,结果表明,在优化后的产酶条件下,当微晶纤维素和麦芽浸粉分别为13.19g/L和11.03g/L时,实际测定的滤纸酶活可以达到5.986U/ml,接近软件预测的最大值6.082U/ml。 对出发菌株及4株突变菌株的基因组DNA进行RAPD分析,并对RAPD-PCR的反应体系进行优化。筛选出6个随机引物后,对它们的扩增条带进行聚类分析,结果显示这5株菌的遗传相似系数在0.6046512-0.8837209之间,表明它们之间有较近的亲缘关系,但存在一定的遗传变异。
【学位授予单位】:中南林业科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:TQ925

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