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《中南林业科技大学》 2011年
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油茶FBPase基因和GAPDH基因的全长cDNA克隆及原核表达分析

曹彦妮  
【摘要】:油茶(Camellia oleifera)种子含油率较高,是我国南方重要的木本食用油料树种。虽然目前已从油茶中分离出了一些基因,但还有大量基因未被分离鉴定出来,难以满足油茶的品种改良的要求。FBPase和GAPDH是光合作用暗反应中非常重要的调控酶,克隆FBPase基因和GAPDH基因,解析FBPase基因和GAPDH基因的结构和功能,研究FBPase和GAPDH的基因调控机制,有利于揭示油茶光合作用的过程和机理,为提高油茶的光能利用率和油茶产量提供科学依据。为此,我们开展了油茶FBPase和GAPDH的基因克隆、酶结构特点及活性、原核表达的研究,主要研究结果如下: 1.油茶FBPase和GAPDH基因的全长克隆。在本实验室已构建的油茶cDNA文库和EST文库的基础上,利用专业软件Primer Premier 5.0设计引物,以油茶优良无性系“湘林1号”的近成熟种子为材料,将提取的RNA反转录后的cDNA作为模板,采用5'RACE技术和3'RACE技术获得了FBPase基因和GAPDH基因的片段,将产物克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5a菌株,进行测序验证。通过网上BLAST比对测序结果,确认其为油茶的FBPase基因和GAPDH基因的全长cDNA序列,将该2个基因分别命名为co-fbp和co-gapdh。其中,油茶FBPase基因的完整cDNA序列长度为1356 bp, ORF为1023 bp;油茶GAPDH基因的完整cDNA序列长度为1364 bp, ORF为1014 bp。 2.油茶FBPase和GAPDH的生物功能预测。应用一系列生物信息学软件分析结合在线软件分析,结果表明:油茶FBPase蛋白分子量为37.7K Da,理论等电点为5.54,其中负电荷氨基酸残基数目为44,正电荷氨基酸残基数目为38,属于稳定蛋白质,有三个比较明显的跨膜区,二级结构分析其有12个α螺旋,其编码蛋白不含二硫键,证明此油茶FBPase基因不受光调控,推测其为胞质FBPase,其活性被AMP所抑制,最佳活性的pH为8.0;油茶GAPDH基因编码的蛋白质理论等电点为5.08,其分子式可写成C3033H5054N101401282S216,油茶GAPDH蛋白质属于不稳定蛋白质,不稳定系数为44.50,该蛋白在大肠杆菌中半衰期大于10个小时,脂肪系数为25.15,平均亲水性0.692,该蛋白没有跨膜区域,二级结构分析其有7个α螺旋。 3.油茶FBPase和GAPDH基因的原核融合表达。分别设计了两对特异表达引物,选用限制性内切酶Ndel和HindⅢ,构建了油茶FBPase和GAPDH的融合表达载体pET-28b-FBPase和pET-28b-GAPDH,并成功在大肠杆菌中表达。结果显示:重组油茶FBPase蛋白在IPTG诱导1个小时后出现大量表达,随着诱导时间的递增,表达量有明显增加;重组油茶GAPDH蛋白在加入诱导剂IPTG诱导2个小时后明显表达,随后的3h、4h、5h内,其表达量增加趋势缓和。
【学位授予单位】:中南林业科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S794.4;Q943.2

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