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《南华大学》 2011年
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鹦鹉热嗜衣原体CPAF重组蛋白在诊断中的应用研究

王绍胜  
【摘要】:目的:从鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci, C.psittaci, Cps)中筛选出CpsCPAF序列,分析挑选其免疫优势表位,进行体外克隆表达与纯化。用该重组蛋白建立血清学诊断方法,评价其在Cps感染血清学早期诊断中的应用。期望筛选出能应用于Cps抗体检测的抗原,丰富Cps感染血清学诊断的候选抗原库,为建立Cps感染的快速诊断奠定实验基础。 方法:应用分子生物学技术,选择Cps6BC株的CPAF蛋白免疫优势区基因,进行构建pGEX6p-2/CPAFm重组质粒,并用IPTG诱导其蛋白表达,结果用SDS-PAGE蛋白电泳和Western blot鉴定;重组蛋白以GST琼脂糖凝胶FF进行纯化,以纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立其血清学诊断的间接ELISA法;重组蛋白的免疫反应性以Western blot和间接ELISA方法分析;用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔,以鉴定重组蛋白的免疫原性。并同时用已有的ELISA试剂盒与建立的间接ELISA方法检测Cps感染血清标本,比较他们的敏感性与特异性,以便该重组蛋白在Cps感染诊断中的应用价值进行评估。 结果:在线分析CPAF基因,筛选出目的基因片段(586~1351bp位碱基,共765bp),并扩增出CPAF基因目的片段;经酶切和测序鉴定证明构建的重组质粒插入序列正确。经SDS-PAGE蛋白电泳与Western blot分析,证实重组菌所表达的蛋白为CPAF蛋白,大小约为54 kDa,且目的蛋白为包涵体。包涵体经复性纯化后,纯度在95%以上。经Western blot分析鉴定,能特异性的结合CpsCPAF阳性血清,具有良好的反应原性。将纯化的CPAF重组蛋白免疫新西兰兔,证实该重组蛋白具有良好的免疫原性,且兔免疫血清特异性抗体效价大于1:8000。自建的间接ELISA法以纯化的CPAF重组蛋白为诊断抗原,与Cps参考血清反应,符合率均为100%。与肺炎嗜衣原体(C. pneumoniae, Cpn),沙眼衣原体(C. trachomatis, Ct)无交叉反应。对180份病鸭血清标本进行检测,与商品Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA试剂盒比较。自建的ELISA法符合率均为100%,Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA Kit符合率为77.5-95%。 结论: 1.成功构建pGEX6p-2/CPAFm重组质粒,在E.coli BL21中诱导表达出分子量为54kDa的CPAFm重组蛋白; 2.纯化的CPAF重组蛋白能与Cps阳性血清特异性结合,具有良好的免疫反应性,可作为Cps感染的血清学诊断候选抗原;同时具有较好的免疫原性品质,可刺激新西兰兔产生高效价的特异性抗体; 3.以CPAF重组蛋白建立的间接ELISA法的特异性与敏感性均高于商品Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA试剂盒。
【学位授予单位】:南华大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R446.6

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