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《南华大学》 2011年
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肺炎嗜衣原体CPAFm-mAb的制备和沙眼衣原体L2在不同细胞内的生长情况

张军华  
【摘要】:目的:制备抗肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae, Cpn)蛋白酶样活性因子(Chlamydial protease–like activity factor,CPAF)免疫优势区(181~400aa,CPAFm)基因重组蛋白的单克隆抗体(mAb),并用此mAb建立ELISA方法,检测临床咽拭子标本,评价该mAb在Cpn早期感染诊断中的应用价值,为制备Cpn感染快速诊断试剂盒提供实验依据。 方法:通过查阅文件并利用生物信息学软件,筛选CPAF免疫优势区基因,以Cpn CWL029株基因组DNA为模板,高保真PCR扩增目的基因,构建pGEX6p-2/CPAFm重组质粒;将重组目的基因转化到E.coli BL21中,经IPTG大剂量诱导表达蛋白,利用GST亲和层析法纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE和Western-blot分析和鉴定产物;并在核酸蛋白分析仪中测定纯化的蛋白浓度;用纯化的CPAFm重组蛋白免疫6只BALB/c小鼠,用ELISA方法检测小鼠血清中特异性抗体效价;取血清抗体效价高的小鼠的脾细胞,利用细胞融合技术,与骨髓瘤细胞SP2/0融合,制备杂交瘤细胞,利用间接ELISA法筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株;采用有限稀释法对阳性细胞株连续筛选3次,并进行单克隆扩大培养;体内诱生腹水法制备腹水型mAb,硫酸铵沉淀法纯化,ELISA法和Western-blot法检测mAb免疫反应性和效价,用mAb亚类测定试剂盒检测mAb的类型;建立ELISA法检测Cpn标准株和临床呼吸道患者咽拭子中的Cpn抗原。 结果:pGEX6p-2/CPAFm重组质粒在E.coli BL21中经IPTG诱导表达了相对分子量(Mr)约为51kDa的目的蛋白;目的蛋白以包涵体形式大量表达。复性后经GST纯化试剂盒纯化,获得纯度在95%以上的目的蛋白。用纯化后的目的蛋白免疫小鼠,间接ELISA法检测血清中特异性抗体,其效价达到1:16000以上。取血清抗体效价高的小鼠脾细胞,采用细胞融合技术,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,制备出稳定分泌mAb的4株杂交瘤细胞,分别命名为8E3、9G4、13D1和13D10。采用体内诱生法大量制备腹水型mAb,并用饱和硫酸铵沉淀法纯化,经Western blot鉴定,腹水型mAb与CPAFm重组蛋白发生免疫反应,经mAb亚类测定试剂盒测定,杂交瘤细胞株8E3和13D1分泌的mAb为IgG1,13D10和9G4分泌的mAb为IgG2b。用自制腹水型mAb采用ELISA法检测550份临床咽拭子标本,没有检测出阳性标本,而同时用PCR检测出7例阳性标本。 结论: 1) 4株杂交瘤细胞株分泌的mAb均为IgG类抗体,能识别CPAFm重组蛋白和CPAF的天然抗原表位,具有良好的特异性; 2)自制腹水型mAb效价较低,可能是导致用此mAb建立的ELISA方法灵敏度低的原因之一 第二部分沙眼衣原体L2在不同细胞内的生长情况 目的:研究沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)血清型L2在体外培养中的繁殖规律,探讨L2在体外连续培养的方法,初步确定L2在体外培养的最佳生长发育条件,为临床标本中L2的分离培养和进一步研究L2的相关实验奠定基础。 方法:用沙眼衣原体L2分别感染人喉癌细胞(Human Epidermoid Carcinoma-2, HEp-2)、人宫颈癌细胞(Henrietta Lacks strain of cancer cells,HeLa229)、人肝癌细胞株hepG-2(Human hepatoma cell line, HepG-2)、胃癌细胞(SGC-7901)和非洲绿猴肾异倍体细胞(Vero cells),荧光抗体染色,荧光显微镜下观察培养不同时间后包涵体的形态,比较其在不同细胞内的生长情况,比较不同细胞对L2的敏感性。同时分别设DEAE葡聚糖处理组与非处理组,放线菌酮处理组与非处理组,通过比较培养12h、24h、36h和48h后包涵体形态及RT-PCR定量检测的核酸量,判断DEAE和放线菌酮对沙眼衣原体血清型L2生长的影响。 结果:在感染24h后,光学显微镜下观察到HEp-2细胞、Vero细胞、HepG-2细胞、HeLa细胞和胃癌细胞中均不同程度肿胀,5种细胞内均可见包涵体,大约40~48h后包涵体占据整个胞浆。荧光抗体染色法和RT-PCR结果显示5种细胞中HeLa细胞感染率最高,HepG-2细胞感染率最低,L2在HeLa细胞中生长速度最快;荧光显微镜下进行包涵体计数,发现DEAE葡聚糖预处理组和对照组中L2的感染率和生长发育没有明显区别。放线菌酮组中各细胞内L2生长速度较对照组快,Real-Time PCR检测结果显示放线菌酮组各细胞内L2核酸量较对照组高。 结论: 1)沙眼衣原体L2可感染HEp-2细胞、Vero细胞、HepG-2细胞、HeLa细胞和SGC-7901细胞,不同细胞对L2敏感性不一样,并且在不同细胞内生长情况也有明显差异; 2)放线菌酮对L2包涵体的形态和密度有影响; 3) DEAE葡聚糖对L2的感染率没有明显影响。
【学位授予单位】:南华大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R392.1

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