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《南华大学》 2006年
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人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达及对巨噬细胞分泌功能与凋亡的影响

蒋永林  
【摘要】:目的:构建人乳头瘤病毒16型(HPV 16)E6蛋白真核表达载体pcDNA3.1(-)/E6,研究E6蛋白瞬时高表达对LPS诱导的THP-1巨噬细胞细胞因子分泌及地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡的影响,为进一步研究E6蛋白在HPV16致癌机理中的作用提供一定的实验依据。 方法:用Primer5.0引物设计软件设计引物,聚合酶链反应(PCR)扩增HPV16 E6基因。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接,经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及测序分析后,亚克隆至pcDNA3.1(-)真核表达载体中;重组质粒经双酶切鉴定后转染THP-1巨噬细胞,SDS-PAGE与Western-blotting鉴定E6蛋白在THP-1巨噬细胞中的表达;将pcDNA3.1(-)/E6转染THP-1巨噬细胞,转染后24h加入终浓度为100ng/mL的LPS诱导,分别在诱导后12h、24h、48h收集培养上清用ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α、IL-1β的含量,并用显微计数法观察E6蛋白瞬时高表达对地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡的影响。利用统计软件SPSS12.0对实验数据作统计分析。 结果: (1)PCR产物克隆至pUCm-T载体上后,双酶切及测序结果表明所克隆的目的片段与GenBank上公布的HPV16 E6基因序列完全一致,将该目的片段亚克隆至真核载体pcDNA3.1(-)上,所构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)/E6转染THP-1巨噬细胞,SDS-PAGE与Western-blotting结果显示pcDNA3.1(-)/E6可以在THP-1巨噬细胞中表达分子量约为18KD的E6蛋白。 (2)pcDNA3.1(-)/E6+LPS组培养上清中TNF-α、IL-1 β的量明显低于巨噬细胞+LPS
【学位授予单位】:南华大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R373

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