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《南华大学》 2008年
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C-型利钠利尿肽抑制血管钙化的作用及机制研究

陈晶晶  
【摘要】: 研究背景:血管组织钙化是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病血管病变等疾病患者中共同的病理表现。近年研究证明血管钙化是一个类似于骨发育的主动的、高度可调的过程。国外实验室发现了一些血管局部旁/自分泌的活性物质对血管钙化形成过程具有重要调节作用。C-型利钠利尿肽(C-type natriuretic peptide,CNP)是一种重要的骨生长调节因子,损伤血管或动脉粥样硬化病变处的血管内皮和平滑肌细胞可以合成CNP,它可能通过自身受体局部发挥重要的旁/自分泌功能。有关CNP在血管钙化中的作用研究甚少。国内实验室以前在整体钙化大鼠血管和离体钙化的血管平滑肌细胞(vascluar smooth muscle cells,VSMCs)上观察到外源性CNP改善血管和细胞钙化,提示CNP系统可作为内源性的血管钙化防御体系。血管钙化时血管组织中CNP/CNP受体的变化、作用及其病理生理意义目前尚不清楚,同时CNP抑制血管钙化的机制目前仍未阐明。 目的:本工作拟在维生素D3和尼古丁(VDN)诱导的血管钙化大鼠模型及离体培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)中观察血管组织内源性CNP及其受体(NPR-A、NPR-B和NPR-C)的变化和外源性CNP对血管钙化的影响,并进一步在离体培养的VSMCs中探讨CNP抑制钙化的机制。 方法:用肌注维生素D3和尼古丁灌胃诱导大鼠血管钙化(VDN组大鼠),背部皮下埋泵CNP(500ng/kg.h)持续给药4周。对照组动物肌注生理盐水和单纯花生油灌胃,方法同钙化组。两组动物以相同饲料饲养4周后进行心功能指标检测。取动脉血检测钙含量,并摘取心脏和主动脉血管称重,用von Kossa染色方法检测钙沉积。培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞用β2磷酸甘油丙酮酸钠处理,培养14天后收集,检测钙含量并用vonKossa染色方法检测钙沉积;采用放射免疫分析的方法测定CNP及cGMP含量;半定量RT-PCR的方法测定组织细胞中CNP/NPRs mRNA的表达变化情况;Real Time RT-PCR方法测定组织细胞中OPN、MGP、BMP-2、cbfα-1 mRNA的表达变化;Western blot方法测定组织细胞OPN蛋白含量。 实验分组一:雄性Sprague-Dawley大鼠(体重180~200 g)随机分三组(每组n=10):(1)对照组(CON):给予等量生理盐水肌注、单纯花生油灌胃代替维生素D_3和尼古丁;(2)血管钙化组(VDN):实验第一天早上9:00给予维生素D_3(300,000 IU/kg)肌注,尼古丁溶于花生油(25 mg/kg,5 ml/kg),灌胃,晚18:00尼古丁重复灌胃一次;(3)血管钙化+C-型利钠利尿肽组(VDN+CNP):除给予维生素D_3和尼古丁同VDN组外,背部皮下埋泵(500ng/kg.h)持续释药4周; 实验分组二:(1)对照组(CON):普通细胞培养液培养VSMCs;(2)钙化细胞组(Cal组):培养液中加入10mmol/Lβ-甘油磷酸盐;(3) Cal+H7组:在钙化培养液内加入PKG的抑制剂H7(浓度为1×10~(-5)mol/L);(4) Cal+CNP1组:在钙化培养液内加入CNP(浓度为10~(-9)mol/L);(5) Cal+CNP2组:在钙化培养液内加入CNP(浓度为10~(-7)mol/L);(6) Cal+CNP+H7组:在钙化培养液内分别加入CNP(浓度为10~(-7)mol/L)和PKG的抑制剂H7(浓度为1×10~(-5)mol/L)。(7) CON+CNP组:正常VSMCs加入CNP(10~(-7) mol/L);(8) CON+CNP+H7组:正常VSMCs加入CNP(10~(-7) mol/L)和H7(10~(-5) mol/L);每二日更换一次培养液,培养7天。 结果:1.VDN组大鼠von Kossa染色见血管组织有大量钙盐的沉积。与对照组相比,VDN组大鼠血管钙含量及碱性磷酸酶活性分别升高73%和126%(P均小于0.01);血管CNP含量有所增加;钙化血管CNP和NPR-B mRNA分别较对照组降低了16%和95.7%(P<0.05);而NPR-CmRNA的水平是对照组的21倍。MGPmRNA水平较对照组高55.2%(P<0.05),BMP-2 mRNA水平是对照组的1.5倍(P<0.05)。血管OPN蛋白表达亦明显上调,为对照组的1.4倍(P<0.01)。CNP组大鼠血管总钙含量和碱性磷酸酶活性与VDN组相比分别降低39.2%和51.9%(P均小于0.01);MGP mRNA水平较VDN组低35.7%(P<0.05),BMP-2mRNA水平较VDN组低64.8%(P<0.05)。血管OPN蛋白水平较VDN组低44.6%(P<0.01),血管cGMP合成增加,分别较对照和VDN组升高46.8%和57.1%(P均小于0.01),提示CNP可能通过cGMP/PKG途径防止血管发生钙化。2.离体用β-磷酸甘油培养大鼠VSMCs 7 d,VSMCs发生表型转换和钙化。细胞培养液中CNP含量增加;von Kossa染色见细胞内外有大量钙盐的沉积。Westernblot显示,发生表型转换和钙化的VSMCsα-actin表达明显降低。细胞钙含量及碱性磷酸酶活性与对照组相比分别升高111.3%和80.9%(均P<0.01);钙化的VSMCs中内源性CNP及其受体NPRs mRNA表达水平与体内实验结果一致:CNP和NPR-B mRNA分别较对照组降低35.3%和64.6%(P<0.05);NPR-CmRNA的水平则较对照组增加了32.7%(P<0.05)。OPN mRNA水平较对照组高92.4%(P<0.01),BMP-2 mRNA水平是对照组的1.12倍(P<0.01),cbfα-1mRNA水平较对照组低31.8%(P<0.05)。钙化血管平滑肌细胞OPN蛋白的表达亦明显上调,是对照组的1.03倍(P<0.01)。10~(-9)M和10~(-7)M的CNP使细胞内钙含量分别降低40.4%和53.4%(均P<0.01),ALP活性分别降低36.3%和58.3%(均P<0.01),CNP使VSMCs中骨桥蛋白(osteopontin,OPN)mRNA及蛋白水平呈浓度依赖性下调,较钙化组细胞分别下降36.4%(P<0.05)和48.3%(P<0.01)。同时,CNP使VSMCs中BMP-2 mRNA水平较钙化组细胞降低33.2%(P<0.05),而cbfα-1mRNA水平没有明显变化,提示CNP可能通过下调BMP-2发挥抑制VSMCs表型转换及钙化的作用。给予PKG阻断剂H7对正常及钙化VSMCs钙含量和OPN蛋白表达没有影响,却明显阻断了CNP的作用,使钙化VSMCs内钙含量增加,OPN蛋白表达升高,而CNP对正常VSMCs钙含量和OPN蛋白表达没有影响。Real Time RT-PCR显示OPN、BMP-2mRNA水平较单纯CNP刺激作用分别增加51.3%和53.8%(P<0.05),而cbfα-1 mRNA表达没有变化,提示CNP可通过cGMP/PKG通路调节OPN、BMP-2mRNA的表达水平。 结论:1.外源性CNP具有显著抑制血管和细胞钙化、阻止VSMCs的成骨样细胞表型转化的作用,是治疗血管钙化的新靶点。2.CNP可能通过CNP-CNP受体-cGMP途径抑制血管钙化。3.CNP可能通过cGMP/PKG信号通路下调高效骨诱导因子BMP-2的基因表达,抑制VSMCs表型转换及钙化,这很可能是CNP通过旁/自分泌途径抑制血管钙化的重要机制之一。
【学位授予单位】:南华大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R543

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