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《湖南中医药大学》 2011年
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加味丹参饮诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

谭琦  
【摘要】:目的: 探讨加味丹参饮(Jia Wei Dan Shen Yin JWDSY)在体外能否诱导骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells BMSCs)向心肌样细胞分化,以及JWDSY对BMSCs移植心肌梗死心血瘀阻型大鼠心肌的作用。 方法: 实验一:采用全骨髓贴壁法培养大鼠BMSCs,并进行传代、扩增,对细胞形态学和生长特性进行观察,通过流式细胞术对细胞表面抗原CD90、CD11b、CD45进行表型鉴定。采用水提醇沉法制备JWDSY的提取物并通过MTT法检测不同浓度JWDSY提取物对BMSCs的毒性作用及增殖的影响。 实验二:体外诱导BMSCs,将培养的BMSCs分为4组:正常对照组、5-Aza组、JWDSY组和JWDSY+5-Aza组进行诱导分化。通过免疫组化的方法检测心肌细胞特有的结蛋白Desmin、肌球蛋白MHC和肌钙蛋白T的表达,用RT-PCR的方法检测心肌转录因子GATA-4 mRNA的表达。实验三:建立大鼠急性心梗心血瘀阻模型,正常组大鼠10只,60只造模成功大鼠分为4个组:模型组、JWDSY组、BMSCs组和JWDSY+BMSCs组。移植28d后,免疫组化双染法检测大鼠心肌组织中心肌结蛋白Desmin和肌球蛋白重链MHC的表达,Masson三色染色法检测大鼠心肌组织心室肌瘢痕面积百分比和心肌血管新生情况,RT-PCR法检测大鼠心肌组织中心肌细胞转录因子GATA-4 mRNA的表达。 结果: 实验一:经流式细胞术鉴定通过全骨髓贴壁法培养的BMSCs纯度较高,细胞表面抗原CD90阳性细胞达到95%以上,CD11b和CD45阳性细胞小于5%,符合实验要求。MTT结果显示,0.625mg/mL的JWDSY为进行BMSCs诱导的工作浓度。 实验二:体外对BMSCs进行诱导后,正常对照组中未发现MHC、Desmin知CTnT阳性细胞;JWDSY组、5-Aza组和JWDSY+5-Aza组免疫组化染色均可见阳性免疫复合物。经JWDSY+5-Aza联合诱导后的BMSCs其MHC表达量高于JWDSY组和5-Aza组,差异有统计学意义(P0.05),JWDSY组与5-Aza组两组间差异无统计学意义(P0.05)。经JWDSY+5-Aza联合诱导后的BMSCs其Desmin表达量高于JWDSY组和5-Aza组,差异有统计学意义(P0.05),JWDSY组与5-Aza组两组间差异无统计学意义(P0.05)。经JWDSY+5-Aza联合诱导后的BMSCs其CTnT表达量高于JWDSY组和5-Aza组,差异有统计学意义(P0.05),JWDSY组与5-Aza组两组间差异无统计学意义(P0.05)。JWDSY+5-Aza组、JWDSY组和5-Aza组GATA-4 mRNA相对光密度值与正常对照组比较差异具有统计学意义(P0.05)。 实验三:移植后28d,Masson染色切片结果显示,正常组未见梗死灶和纤维形成,其余各组均出现大小不等的梗死灶,JWDSY组+BMSCs组、JWDSY组和BMSCs组的心室肌瘢痕面积百分比均较模型组显著减小(P0.01);JWDSY组+BMSCs组较JWDSY组和BMSCs组瘢痕面积百分比显著减小(P0.05),JWDSY组和BMSCs组两者之间比较,无显著差异(P0.05)。与正常组比较,各造模组的心肌毛细血管数均增高,差异有统计学意义(P0.05)。JWDSY组、BMSCs组和JWDSY+BMSCs组的心肌毛细血管数较模型组显著增加(P0.01);JWDSY+BMSCs组与JWDSY组和BMSCs组比较,心肌毛细血管数增加有显著性意义(P0.05),JWDSY组和BMSCs组两者之间比较,差异无显著性意义(P0.05)。在模型组和JWDSY组梗死边缘未见有MHC-Brdu、Desmin-Brdu双染表达;BMSCs组和JWDSY+BMSCs组均可见猩红色Brdu抗体着色和棕色MHC蛋白的同时表达以及猩红色Brdu抗体着色和棕色Desmin蛋白的同时表达。JWDSY+BMSCs组的阳性细胞计数高于BMSCs组(P0.05)。RT-PCR检测GATA-4 mRNA的表达结果显示,正常组和模型组未见到阳性条带,JWDSY组阳性条带较弱,BMSCs组和JWDSY+BMSCs组可见阳性条带,对其IOD值半定量分析JWDSY+BMSCs组高于BMSCs组(P0.05)。 结论: (1)JWDSY在体外能促进BMSCs向心肌样细胞分化,并可以加强5-Aza诱导BMSCs向心肌样细胞分化的作用。 (2)在心梗心血瘀阻证大鼠模型中JWDSY组、BMSCs组和JWDSY+BMSCs均能促进新生血管,增加移植细胞的血供,能缩小梗死面积。而JWDSY能促进BMSCs移植后的血管新生和减少瘢痕形成。 (3)在心梗心血瘀阻证大鼠模型中JWDSY能促进移植的BMSCs向心肌样细胞分化,JWDSY与BMSCs移植联合应用的疗效较单用更佳。
【学位授予单位】:湖南中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R285

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【引证文献】
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