基于Nrf2/ARE信号通路的一种海洋天然产物的抗氧化作用机制研究

【摘要】：目的:通过细胞体外实验检测天然化合物N-Me-trichodermamide B(compound 1)对Ha Ca T细胞中核转录因子Nrf2、抗氧化反应元件ARE及其下游Ⅱ相代谢酶HO-1表达的影响,并探索上游通路的活性。方法:首先通过CCK-8方法筛选出低毒性的化合物,采用流式细胞术并进行氧化应激细胞表型的研究,并最终筛选出1种具有抗氧化应激的化合物。然后通过western blot、RT-q PCR、免疫荧光的方法检测细胞内HO-1的表达情况以及细胞内Nrf2表达的影响;并通过western blot、免疫荧光的方法检测Nrf2的入核情况;通过ARE质粒转染,检测ARE荧光素酶活性;通过Nrf2基因沉默实验,瞬时转染小干扰RNA si-Nrf2进入细胞内,转染成功后再次检测Nrf2、ARE、HO-1的活性表达,探索三者间的活性关系;检测磷酸化的蛋白激酶p38的表达水平;通过用p38特异性抑制剂预处理细胞4个小时,随后用待测化额合物作用于细胞,并检测Nrf2、HO-1的表达情况。结果:筛选出的一种结构新型的单体化合物N-Me-trichodermamide B(以compound 1表示),通过蛋白检测,结果显示,compound 1显著诱导了HO-1蛋白的表达水平,并能明显上调HO-1 m RNA的表达,与对照组相比,结果具有统计学意义;随后检测到,compound 1使Nrf2的核内表达增加,并上调ARE报告基因的活性,与对照组相比,结果具有统计学意义;免疫荧光的方法同样检测到compound 1能够促使Nrf2进入细胞核;沉默Nrf2基因后,HO-1蛋白表达下降、ARE活性减弱。compound 1使磷酸化p38蛋白表达增加,使用了p38特异性抑制剂SB239063后,Nrf2的核内表达下降,HO-1表达下调,与对照组相比,结果具有统计学意义。结论:最终筛选出一种具有抗氧化应激活性的天然化合物compound 1,且该化合物的结构未被报导过。compound 1能通过激活Nrf2/ARE信号通路上调HO-1的表达,并依赖于磷酸化p38蛋白的激活。