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肿瘤细胞耐药行为研究及Bax蛋白的检测

徐丽丽  
【摘要】:恶性肿瘤是人类最致命的疾病之一,化疗是一种常见的治疗手段。然而,化疗经常会导致肿瘤细胞出现耐药性,这是致使化疗失败的重要原因之一。一般认为,肿瘤细胞耐药主要受蛋白介导的药物外排泵机制、酶介导机制和凋亡调控基因介导机制等控制。肿瘤细胞表面Bax等促凋亡蛋白的正常表达可以促进细胞凋亡而抑制其过度生长,其表达水平的下调与肿瘤细胞的耐药性有密切关系,Bax蛋白的检测在医学和细胞生物学上有重要意义。本论文主要以体外培养的肿瘤细胞为研究对象,利用MTT比色分析、电化学方法和酶联免疫分析法,研究了粘附分子介导的肿瘤耐药行为,并对肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞表面的Bax蛋白表达进行了检测。主要内容如下: 1.采用MTT法研究了人骨肉瘤细胞(MG-63)在胞外基质纤维粘连蛋白(FN)上的粘附及对药物5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的影响。与粘附在未修饰FN的基底上的MG-63细胞相比,粘附在FN上的细胞凋亡率明显降低,对药物的耐受程度加强。抗整合素β1抗体(anti-CD29mAb)部分阻断细胞与FN的连接后,肿瘤细胞恢复了对药物的敏感性,说明肿瘤细胞耐药与细胞的粘附行为有密切关系。荧光显微镜的观察实验验证了MTT分析结果的准确性。 2.利用电化学竞争免疫分析法定量检测了肿瘤细胞表面的Bax蛋白。将Bax蛋白和辣根过氧化物酶(HRP)组装到硫堇-石墨烯(TH-GN)修饰的电极表面构建电化学生物传感器。Bax抗体与抗原的结合引起空间位阻效应,导致传感器的电化学响应降低。当抗体组装过程中存在肿瘤细胞或Bax抗原时,由于竞争反应上述效应减弱。最佳检测条件下,差分脉冲伏安法(DPV)得到峰电流的变化程度与细胞浓度在2.5×103到1.6×105cells mL-1范围内成正比,检测限为800cells mL-1。实验求得,在单个MCF-7和MCF-7/ADR细胞表面,Bax蛋白的含量分别为1.204×1011和7.224×1010个分子,证明Bax蛋白的降低是导致肿瘤细胞耐药的一个重要原因。 3.采用酶联免疫分析法(ELISA)检测了肿瘤细胞表面Bax蛋白的表达水平。制备了辣根过氧化物酶-纳米金-Bax抗体复合物(HRP-Au NPs-Ab)并用于结合细胞表面的Bax蛋白。HRP催化过氧化氢(H202)对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)的氧化,产生深蓝色的双偶氮联苯胺化合物。酶标仪检测结果表明,最佳检测条件下,光密度(OD)与细胞浓度在2.5×103到4.0×104cellsmL-’范围内呈良好的线性关系。相对于接种MCF-7/ADR的孔,接种MCF-7的孔具有更高的OD值,表明耐药肿瘤细胞表面Bax蛋白表达水平较低。


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