油茶种质资源多样性的ISSR分析

【摘要】：运用优化的ISSR-PCR反应体系和从100条ISSR引物中筛选获得的22条引物对98个油茶种质资源(51个无性系种质和杂交选育的47个种质)的DNA进行PCR扩增,对其产物的电泳条带进行多样性分析,建立了这些油茶种质资源的ISSR指纹图谱,为油茶种质资源的鉴定提供了理论依据。主要研究结果如下： 1.优化了ISSR分析油茶种质资源多样性的反应体系。总的反应体积25μl中,12.5μ12X Mix(包括DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液)、2gl50ng/μl模板DNA、2μl0.6μmol/L引物、8.5μ ddH20；PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s,56℃退火45s,72℃延伸1min30s,39个循环；72℃延伸7min,4℃保存。 2.运用筛选获得的22条引物,对不同地区的51个无性系油茶种质资源的DNA进行PCR扩增,其产物电泳后检测,共获得493个有清晰条带的(可分析)位点,其中多态性位点478个,多态性位点百分率达96.78%,表明了油茶丰富的遗传多样性。根据NTSYS2.10和Winboot软件计算51个油茶无性系种质间的遗传距离和步长值,并绘制聚类树状图,可将其划分为两大类群,即类群Ⅰ(包含48个普通油茶种质)和类群Ⅱ(包含3个非普通油茶种质),两者相似系数(Gs)为0.620；类群Ⅰ又可分为两个亚类群,相似系数(Gs)为0.634,其中Ⅰ—1皆为湖南种质,Ⅰ-2包括部分湖南种质和源自其他省份(地区)的普通油茶种质。运用POPGENE version1.32软件对不同地区油茶种质(居群)进行统计分析表明,居群Shannon's信息指数(Ⅰ*)为0.3852、居群间基因多样性(Ht)为0.2537、居群内基因多样性(Hs)为0.1555、居群间遗传多样性分化系数(Gst)为0.3967、居群间基因流(Nm*)为0.8262。湖南地区与其他地区居群间的Nei's遗传距离依次为：云南居群福建居群贵州居群广西居群江西居群湖北居群,表明地域距离越远,居群间遗传距离越大。因此,地理隔离可能是构成油茶遗传多样性的重要基础。基于上述ISSR分析建立的DNA指纹图谱,可有效地鉴别不同地区的51个油茶种质资源。 3.同样的22条ISSR引物分别对杂交组合HNDA-1×XL-F-183的13个ZB—8选育株系、XL-183-M1×XL—1的13个ZB—7选育株系和XL-183-M2×XL-1的21个ZB-9选育株系进行PCR扩增,其扩增产物电泳后检测,分别获得359、387、382个条带位点,其中多态性位点分别为293、335、328个。多态性位点百分率分别为81.62%、86.56%和85.86%,均低于51个无性系种质的多态性位点百分率96.78%。因此,来源于同一杂交组合的不同选育株系间虽然也表现出明显的遗传差异或遗传多样性,但比不同地区来源的无性系种质问的遗传多样性要低。统计分析结果表明,ZB—8系列、ZB-7系列和ZB-9系列的平均观察等位基因数(Na*)分别为1.8162、1.8656、1.8586；有效等位基因数(Ne*)分别为1.4835、1.4999、1.4502；基因多样性(h*)分别为0.2834、0.2952、0.2717；居群Shannon's信息指数(Ⅰ*)分别为0.4256、0.4449、0.4150。 三个杂交组合的后代分别与其父、母本相比,其分子性状皆出现广泛分离,与父、母本形成明显差异。因此,杂交育种是产生油茶遗传多样性的重要途径之一。 另外,无性系穗条嫁接于种苗砧木或用于大树换冠后,选育的新种质也表现出不同于原穗条和砧木的分子差异。 以上对我国不同地区油茶种质资源的ISSR遗传多样性分析结果,为油茶种质资源的鉴定提供了理论依据和方法,有利于油茶种质资源的保存和开发应用。