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功能核酸控制沙门氏菌致病性的研究

程莉娟  
【摘要】:沙门氏菌(Salmonella)是一类可引发家畜、家禽及蛋产品污染,导致食物中毒的常见致病菌。同时,由沙门氏菌引起的感染疾病和抗药性对公众健康已构成严重危害。并且,沙门氏菌形成的菌膜在自然界中普遍存在,更加剧了感染疾病的根治难度。然而,常规的抗生素筛选、开发速度早已跟不上耐药菌新增的步伐,为此,尽快发掘新的高效抗菌药物在人类对抗沙门氏菌的这场战斗中至关重要。适配体是经体外筛选技术,即指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)获得的与靶标特异结合的寡核苷酸片段。作为小分子治疗药物来发挥作用是近年来适配体的应用热点。随着SELEX筛选技术的优化改良,更多的适配体被筛选获得,并证实具有抗菌效果。这些适配体往往通过与靶标菌体内的酶、胞外抗原(如鞭毛或菌毛)等紧密结合后而分别干扰细菌的正常代谢、刺激提高机体免疫反应或阻止细菌入侵生物体,最终发挥抗菌作用。鉴于适配体控制病原菌致病性的潜能,本课题基于以上研究背景,开展了以下适配体功能分析工作:(1)候选本室由菌体SELEX技术获得的多条鼠伤寒沙门氏菌(又typhimurium)特异适配体,分别进行序列优化。利用在线软件Mfold对适配体二级空间结构进行预测,在不破坏茎环主体结构的前提下,选取3条亲和力较高的适配体序列进行适当截短以及碱基修改(STY-1、2、3)。实验表明,序列优化后的STY-1、2、3仍然保留对S.typhimurium较高的亲和力,Kd值均在0~100 nM范围内(Kd值分别为 35.2±4 nM、29.9±4 nM、19.3 ±4 nM),其中,适配体 STY-3对S.typhimurium的亲和力较序列调整前有较大幅度提升。序列优化后的适配体不仅在结合靶标菌时具有较强的灵敏性,同时还保留高特异性,能有效区分靶标菌与对照菌种,可作为小分子探针或功能分子应用于后续靶标菌的检测与功能机制研究。(2)以S.typhimurium为靶标,分别检测适配体STY-1、2、3单独和组合搭配时的抑菌效果。实验结果表明:单独作用时,1μMSTY-3抑制菌落生长效果最好(抑制率为74.66± 1.28%);三条适配体组合搭配后,STY-2与STY-3联合抑制菌落生长的效果最好(1 μM STY2+3的抑制率为87.84± 1.14%)。竞争性实验结果显示,STY-1与STY-2具有竞争性结合菌体表面靶标的趋势,提示二者在结合菌体时存在相互干扰或结合同一靶标物质的可能性。在控制菌膜形成的实验中,单独作用时,STY-3抑制作用最强(1 μM STY-3实验组菌膜形成率为50.04±3.71%),组合搭配后STY-2与STY-3联合抑制菌膜生长的效果依然最佳(1μM STY2+3实验组菌膜形成率仅为35.99±2.26%),且具有抑制特异性;但在解离早期菌膜时,适配体单独及组合作用的效率减弱(1.5 μMSTY-3实验组菌膜形成率为61.31 ±4.26%,1.5μM STY2+3实验组菌膜形成率为43.50±4.26%),提示菌膜清除难度增加。本研究将适配体的应用扩展至菌膜治疗领域,在降低细菌耐药性、对抗微生物感染方面具有重要的意义。(3)以s.typhimurium为靶标,分别检测适配体STY-1、2、3单独及组合搭配时抑制靶标菌黏附猪肠上皮细胞IPEC-J2的作用。实验结果显示,这三条适配体同样能有效降低S.typhimurium.对IPEC-J2细胞的黏附效率,且STY-3的黏附抑制效果最佳(2 μM时黏附抑制率为49.98±1.93%);适配体联合作用效果较单独作用时抑制效果增强,且组合STY2+3作用最佳(2 μM时黏附抑制率为67.26±1.64%)。黏附抑制、黏附竞争以及黏附置换三组实验的结果差异提示,适配体干预致病菌黏附的效果与适配体加入的浓度和时间点密切相关。上述结果为适配体控制沙门氏菌的致病性提供了新的研究思路。(4)选取本室前期筛选获得的猪霍乱沙门氏菌(Scholeraesuis 鞭毛特异适配体SC-3,使该适配体与氨苄西林进行共价连接,构建为适配体-氨苄西林连接物(SC3-Amp),并探讨此连接物对S.choleraesuis菌膜的影响。实验结果显示,SC3-Amp连接物有效发挥了适配体的特异结合作用和氨苄西林的抑菌作用,在治疗菌膜时其效果明显强于组分单独发挥作用时,菌膜形成抑制实验中菌膜形成率仅为28.36±0.57%,早期菌膜解离实验中菌膜形成率为仅40.00±2.70%。菌膜抑制和解离作用效果的差异提示,菌膜的控制宜在初期采取措施。因此,这种抗生素联合靶向性适配体的设计思路可扩展应用于更多的抗生素与适配体,对未来开发新型抗菌膜的功能核酸药物具有重要意义。


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