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《湖南师范大学》 2019年
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利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼cxxc5a基因敲除品系

王宏波  
【摘要】:目的:CXXC5基因具有广泛表达性及进化保守性,在心脏中高表达,已被证实影响斑马鱼发育早期的心肌细胞增殖和心脏环化。基因编辑技术是一种精准而高效的基因工程方法,它可以通过对特定DNA片段的插入、敲除、修饰或替换等,实现对生物体中目标基因的编辑;CRISPR/Cas9是当今生命科学领域最具有发展前景的基因编辑技术。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了斑马鱼cxxc5a基因的基因敲除品系,以期利用该模型对cxxc5a基因影响心脏早期发育的具体机制进行进一步的探究。方法:首先通过在线分析,获取cxxc5a基因的完整序列和其他相关信息,并利用生物信息学软件在cxxc5a基因二号外显子上设计两个评分较高的打靶位点和打靶鉴定引物,采用“双靶位点敲除”的方式进行基因敲除。(1)打靶载体的构建:分别合成打靶用的gRNA引物和鉴定引物,通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、DNA回收纯化、体外转录等一系列操作,最终获得打靶用的高纯度gRNA和hCas9 mRNA。(2)显微注射:将构建好的高纯度打靶gRNA与hCas9mRNA按照一定的比例混合后,采用显微注射的方法注入野生斑马鱼一细胞期胚胎中。(3)敲除效果的检测与分析:注射后的F0代胚胎培养72 h,随机选取一定数量的胚胎提基因组,通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、DNA回收纯化、连接pMD18-T载体、转化、克隆、提质粒、测序、序列比对等一系列工作进行打靶有效性分析。剩余胚胎继续培养4个月至性成熟后,剪取成年F0代斑马鱼尾提基因组,重复上述打靶有效性分析中涉及的实验操作步骤,最终筛选并获得有效敲除了cxxc5a基因的斑马鱼F0代嵌合突变体。(4)F1代基因敲除斑马鱼的筛选及研究:将上述的F0代嵌合突变体与野生型斑马鱼进行杂交,检测并分析获得的F1代斑马鱼胚胎;培养72 h后随机选取一定数量的胚胎提基因组,通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳等初步鉴定F0代斑马鱼的cxxc5a基因敲除是否有效遗传至F1代;继续将剩余的F1代胚胎培养至5个月性成熟后,剪取其尾部提基因组,检测分析,最终筛选敲除了cxxc5a基因且能够稳定遗传的斑马鱼F1代杂合突变体。结果:体外成功合成高纯度的打靶gRNA和hCas9 mRNA;显微注射后F0代胚胎打靶有效性分析的PCR产物凝胶电泳出现目的条带,进一步的测序和序列比对显示,F0代胚胎cxxc5a基因于两个靶位点间发生碱基序列缺失,胚胎内发生了预期的基因编辑;F0代成鱼嵌合突变体筛选的PCR产物凝胶电泳出现目的条带,进一步的测序和序列比对显示,部分F0代成年斑马鱼个体的cxxc5a基因发生移码缺失突变,成功获得F0代嵌合突变体;选择适宜的F1代胚胎,初步分析并鉴定该基因敲除品系是否遗传至F1代,不过其PCR产物的凝胶电泳结果显示未出现相应的目的条带;将F1代胚胎培养至性成熟后,继续筛选基因敲除稳定遗传的F1代杂合突变体,在目前已完成筛选的斑马鱼F1代个体中,其PCR产物的凝胶电泳结果也未出现目的条带,原因尚在分析中。其余F1代的筛选工作也正在进行中。目前还不能确定F0代基因敲除已经稳定遗传至F1代。结论:本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对斑马鱼的cxxc5a基因进行了有效的编辑,使之产生移码缺失突变,在胚胎整体水平上敲除了cxxc5a基因,得到了嵌合突变体,为后续的基因敲除纯合品系的构建奠定了重要基础。
【学位授予单位】:湖南师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:Q78;R-332

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