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苏云金杆菌cry1Aa基因的表达和定点突变

史红娟  
【摘要】:文献报道昆虫中肠液pH值变化使其对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)杀虫剂产生抗性,其生理机制有待进一步探索。本研究运用改进的SDS碱裂解法抽提Bt 4.0718菌株的质粒,通过PCR分析证实其P3质粒上含有crylAa基因。采用生物信息学方法通过比较crylAa基因的同源性,设计引物从P3质粒上直接扩增出crylAa基因的ORF,亚克隆至pMD18-T载体,经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切后连接pET30a载体并转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),获得的重组菌株ETAa经诱导,高效表达了141-kD融合蛋白。 本研究中,针对cry1Aa基因设计出三条特异引物,采用二步PCR法引入突变。将第一步PCR反应产物作为第二步PCR反应的大引物,扩增获得的1048-bp片段亚克隆至pMD18-T载体,pMDMX质粒用NHe Ⅰ和BssH Ⅱ双酶切,获得224-bp突变片段,与经同样酶切消化的pMDAa连接转化,获得重组质粒pMDMa,pMDMa用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切获得的3.5-kb片段与经同酶切的pET30a载体连接并转化,得到C812A、C814A的突变株ETMa。突变株经IPTG诱导后同样获得高效表达。 未突变菌株ETAa和突变菌株ETMa产生的包涵体均在不同pH值和β-巯基乙醇浓度下溶解,结果显示在相同的pH值和β-巯基乙醇浓度下,突变株产生的包涵体更易溶解,而且在较低的pH值和β-巯基乙醇浓度下,突变株产生的包涵体的溶解性也更好。证明C812A、C814A的突变确实能显著改变包涵体的溶解性。本研究提供了一种有潜在价值的抗性管理策略,对于阐明二硫键对原毒素分子的稳定性及毒性的影响具有重要意义。


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