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苏云金杆菌伴孢晶体20-kb DNA中cry1Ac基因的高效表达和生物活性研究

胡宏源  
【摘要】:已经证实苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)伴孢晶体中结合有20-kb DNA,但其序列特异性及作用有待进一步研究阐明。研究了选择性溶解Bt 4.0718菌株Cry1类原毒素所形成的菱形伴孢晶体,从中抽提出与其结合的20-kb DNA。经Nde Ⅰ酶切消化后亚克隆构建文库,利用PCR-RFLP及测序,筛选出含cry1Ac基因的转化子,然后设计引物通过PCR扩增出cry1Ac基因的ORF,并与pET30a连接,转化Ecoli BL21(DE3),高效表达了141 KD蛋白,表达蛋白占总蛋白量的50%以上,且90%以上以包涵体形式存在。 利用穿梭载体pHT304构建表达质粒pHTX42,电转化Bt无晶体突变株XBU001,获得重组菌株HTX42,经SDS-PAGE分析,cry1Ac基因得到强表达,蛋白质定量分析显示目的蛋白量占总蛋白量的79.28%,且其在细胞中累积达细胞干重的64.13%,这种产量比文献报道的25%左右增高了一倍以上。 原子力显微镜(Atomic Force Microscopy,AFM)检测显示,目的基因在大肠杆菌(E.coli)中表达的包涵体呈不规则形状且较小,而在无晶体突变株中表达的晶体呈典型菱形晶体,大小约为1.2×2.0μm。生测结果显示,包涵体与晶体对小菜蛾(Plutella xylostella)三龄幼虫均有高效杀虫活性,其中包涵体以2d的LC_(50)为20.5 μg/ml,晶体以2d的LC_(50)为6.25 μg/ml。从ETX35菌株的包涵体和HTX42菌株的晶体中分别抽提DNA,并进行PCR鉴定,证明其中的20-kbDNA片段具有序列多态性。 本研究为构建高效杀虫工程菌及进一步阐明Bt伴孢晶体中20-kbDNA分子的来源、结构和功能奠定了重要的基础。


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