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几种重要的细胞分泌蛋白质组研究

柳亦松  
【摘要】: 分泌蛋白(secretory protein)参与细胞信号的传导、细胞增殖、分化和凋亡的调控、生物体的发育等重要生命过程。了解不同发育、生长时期和不同生理、病理条件下及不同类型细胞分泌蛋白表达的特点对认识生命过程具有重要意义。分泌蛋白质组的研究有助于我们找到直接与特定生理或病理状态相关的生物分子,并且为从分子水平上认识疾病的发生和发展过程提供理论依据,也为设计作用于特定靶分子(target molecule)的药物筛选奠定基础。本研究选择了几种不同的原代细胞和细胞系为研究的模式材料,利用蛋白质组学技术对分泌蛋白进行研究,进行了分泌蛋白组的方法学,表达谱,以及特异性的生物标志物的相关研究。 首先,开展大规模的蛋白质组研究的必备条件是高分辨蛋白质分离技术和高通量、高灵敏度的鉴定技术。因此在本研究的第二章我们首先优化了窄范围pH梯度胶的二维电泳(2-DE)的分离条件,并利用优化后的参数,建立了鼻咽癌分泌蛋白质2-DE表达谱。随后探索了胶内蛋白质鉴定的策略,建立了基于2-DE,自动切胶和自动酶解基础上的高通量胶上蛋白质点鉴定技术。 其次,利用在第二章鼻咽癌分泌蛋白质组研究中所摸索出来的分泌蛋白质纯化与富集策略,我们开展了嗅鞘细胞分泌蛋白质组表达谱的研究。所不同的是我们采用了优化的一维凝胶电泳和液相色谱串联质谱联合的复杂蛋白质混合物鉴定技术。嗅鞘细胞是一种特殊类型的星型胶质细胞,它兼具了胶质细胞和雪旺式细胞的一些特点。据报道将嗅鞘细胞移植到损伤的中枢神经系统部位可以刺激其不同程度的再生,髓鞘再生和功能恢复。在本论文第三章的研究中,我们应用了SDS-PAGE胶分离与高通量液相串联质谱结合的蛋白质组学技术鉴定嗅鞘细胞条件培养基中的分泌蛋白,同时辅以在线的基因功能分类体系(Gene ontology)来对这些蛋白进行生物学功能预测和研究。我们在嗅鞘细胞条件培养基中鉴定到了168个非冗余蛋白并根据它们的生物学功能来进行分类,其中的大部分蛋白与神经分化和神经再生相关的。非标定量蛋白质组学分析被应用在嗅鞘细胞分泌蛋白质组与胶质细胞分泌蛋白质组的活性组分差异比较研究中,通过蛋白质鉴定的总次数比较(Spectral counting,半定量),我们找到了23个蛋白质在嗅鞘细胞分泌蛋白中上调,14个蛋白质在胶质细胞分泌蛋白中上调。蛋白质印迹法验证了载脂蛋白-E和胰岛素样生长因子结合蛋白质-2等5个在嗅鞘细胞分泌中上调的蛋白。因此,我们认为本实验不但首次大量的鉴定了嗅鞘细胞分泌蛋白质组中的与神经生长和再生相关的蛋白,而且为嗅鞘细胞条件培养基对于中枢神经系统修复的多方面调控作用提供了一些实验证据。 总而言之,通过本研究论文,我们建立了大规模的人鼻咽癌细胞系分泌蛋白质组表达谱以及嗅鞘细胞和星形胶质细胞的分泌蛋白质组表达谱。据我们目前所知,我们所鉴定的嗅鞘细胞分泌蛋白质表达谱的蛋白质数据是目前国际上最大的一个溴鞘细胞蛋白质数据库。其次,本研究从蛋白质组学的不同策略出发,建立起了一套行之有效的基于2-DE和1-DE凝胶电泳技术与质谱连用的分泌蛋白质组研究策略,可以有效的对于不同类型的细胞分泌蛋白质组进行富集和简化分析体系,并且实现潜在的疾病标志物的发掘。该体系将同样的适用于其他的肿瘤或疾病相关的蛋白质标志物的研究。


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