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《南华大学》 2012年
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组织蛋白酶L介导Ox-LDL诱导单层HUVECs通透性增加及其机制探讨

贾小英  
【摘要】:【目的】 观察组织蛋白酶L(cathepsin L,CATL)在氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein, Ox-LDL)诱导单层脐静脉内皮细胞(HUVECs)通透性增加中的作用及其机制探讨。 【方法】 (1)用不同浓度Ox-LDL处理HUVECs24h,Transwell和荧光分光光度法检测HUVECs通透性变化;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印记技术(Western blot)分别检测HUVECs CATL、TET2、VE-cadherin、自噬和凋亡指标的mRNA及蛋白表达情况;用CATL活性检测试剂盒检测HUVECs CATL活性水平;MDC染色观测HUVECs自噬水平,Hochest染色和流式细胞术检测HUVECs凋亡水平。 (2)用不同浓度CATL inhibitor预孵育HUVECs24h,再加入50mg/LOx-LDL处理24h,检测指标同前(1)。 (3)用TET2siRNA转染HUVECs,Western blot检测Beclin-1、LC3、Caspase-3和VE-cadherin蛋白表达。 【结果】 (1)用Ox-LDL(0、25、50和75mg/L)处理HUVECs,实验结果显示:随着Ox-LDL浓度的增加,CATL mRNA表达差异无统计学意义(P0.05),但其蛋白表达及活性显著增加(P0.01);VE-cadherin蛋白表达减少(P0.05),单层HUVECs通透性增加(P0.05)。Beclin-1mRNA和蛋白表达明显增加,LC3mRNA表达差异无显著性,但LC3Ⅰ/LC3Ⅱ明显增加;MDC染色结果显示自噬囊泡染色增加;Caspase-3mRNA表达在50mg/L Ox-LDL组显著上调(P0.001);Ox-LDL处理组Caspase-3蛋白表达显著高于对照组(P0.05);Caspase-9mRNA表达差异无统计学意义(P0.05);Bcl-2mRNA表达呈Ox-LDL处理浓度依赖性降低(P0.01);Hochest染色和流式细胞术结果显示Ox-LDL促进HUVECs凋亡。 (2)用不同浓度CATL inhibitor预孵育HUVECs24h,再加入50mg/LOx-LDL处理24h,实验结果显示:随着CATL inhibitor预处理浓度的增加,Ox-LDL诱导的单层HUVECs通透性降低(P0.01);VE-Cadherin表达增加(P0.01);Beclin-1和LC3mRNA表达差异不显著(P0.05),Beclin-1蛋白表达及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ降低(P0.01);MDC染色结果显示自噬囊泡减少;Caspase-3mRNA和蛋白表达上调(P0.05),Caspase-9mRNA表达差异无显著性(P0.05); Bcl-2mRNA表达增加(P0.01);Hoechst染色和流式细胞术结果显示CATL inhibitor上调Ox-LDL诱导的HUVECs凋亡。 (3)Ox-LDL呈剂量依赖性下调TET2mRNA和蛋白表达(P0.05),CATLinhibitor呈剂量依赖性上调Ox-LDL处理的HUVECs TET2mRNA和蛋白表达。TET2siRNA显著上调HUVECs Beclin-1蛋白表达(P0.001)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(P0.01), TET2siRNA下调HUVECs Caspase-3蛋白表达(P0.01);但TET2siRNA对HUVECs VE-Cadherin蛋白表达差异无统计学意义(P0.05)。 【结论】 CATL介导Ox-LDL对血管内皮细胞自噬和凋亡的调节以及内皮细胞单层通透性的改变,TET2参与此过程。
【学位授予单位】:南华大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R363

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【参考文献】
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