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伏马菌素诱导拟南芥程序性细胞死亡的细胞生物学研究

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【摘要】:伏马菌素B1(Fumonisin B1,FB1)是由串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)产生的一种重要真菌毒素,具有与鞘氨醇长链基相类似的结构。由于FB1危害玉米、水稻、小麦等多种农产品及饲料,涉及到植物、动物以及人类健康和食品安全,研究和发掘其毒性作用机制是急需解决的重要科学问题。虽然已有研究发现FB1能诱导植物细胞发生程序性细胞死亡,引发植株病害,但是参与调控死亡和病害的信号分子,及其致死机理和作用靶标仍然是不清楚的。 本研究以拟南芥野生型、绿色荧光蛋白(GFP)特异标记各种细胞器的株系以及鞘脂代谢途径中的acd5突变体为材料,采用多种细胞生物学技术,结合相关抑制剂的使用,对FB1诱导植物程序性细胞死亡过程中的信号转导、细胞生理状态、细胞器形态和动态变化以及超微结构变化等方面进行了详细研究。 利用荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜观察和流式细胞术,我们发现,在FB1诱导拟南芥原生质体发生细胞死亡的早期,线粒体中产生了大量过氧化氢(H2O2),同时伴随着线粒体跨膜电势的急剧下降。添加自由基清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸后,有效的降低了活性氧并可以部分阻止FB1诱导的细胞死亡。通过钙离子特异荧光染料Fluo-4染色,YC-FRET法与一氧化氮特异荧光染料DAF染色分别对细胞内钙离子和一氧化氮浓度进行了检测,研究发现FB1并不会引起细胞内两者水平发生显著变化。 我们采用GFP特异标记线粒体的拟南芥品系43A9,通过共聚焦显微镜获取大量三维(xyz)和四维(xyzt)的线粒体图片数据,对FB1诱导的细胞死亡过程中线粒体分布、形态、数量、运动轨迹及速率进行了准确而全面的大样本统计分析。研究发现,在对照组中线粒体形态正常,分布规则,运动速率快且运动轨迹复杂。而在FB1诱导的细胞死亡早期,线粒体发生异常的聚集现象;接着线粒体的体积发生极为显著的膨大,同时伴随着线粒体总数目的急剧下降。这些形态和分布异常的线粒体运动的复杂性和速率都显著降低。 通过细胞骨架抑制剂处理和细胞内ATP浓度测定,发现线粒体的形态和动态变化依赖于微丝,而不依赖于微管和细胞内ATP浓度。同时微丝解聚剂能够显著增强FB1对拟南芥原生质体和叶片的致死作用。用FB1处理GFP特异标记微丝的拟南芥品系GFP-FABD2后,发现在线粒体发生明显的形态和动态变化之前,微丝结构就已经遭受到了严重的解聚和降解,说明FB1很可能直接作用于微丝,而微丝结构破坏是造成线粒体动态变化的重要原因。 在电镜下,采用三氯化铈(CeCl3)组织化学染色,我们对FB1诱导拟南芥叶片死亡过程中的亚细胞形态变化及H2O2超微结构定位进行了观察。研究发现细胞死亡早期H2O2信号首先出现在细胞壁上,随着处理时间延长,H2O2信号逐渐增强,随后在线粒体外膜上大量迸发,到死亡后期H2O2信号又逐渐消失了,经历了一个从无到有又到无的一个过程。在亚细胞形态方面,我们观察到了细胞核内膜周围有异染色质凝缩现象,这是程序性细胞死亡的典型特征;在死亡后期,细胞内容物排列紊乱,叶绿体和细胞质中出现了大量的脂滴,还观察到由真菌毒素诱导产生的乳突结构。在注射FB1植株上的未注射叶片的细胞中也观察到了上述相同的信号和结构变化,推测FB1可能通过维管束组织转运至其他叶片进而扩大致病范围。 采用鞘脂代谢途径上的死亡相关拟南芥突变体acd5研究发现,不论是FB1处理还是串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)侵染,acd5突变体都要比野生型显得更为敏感,会更早更多地出现死细胞。实验发现acd5突变体H2O2信号和胼胝质起始的时间和合成的强度都比野生型要晚,要弱。推测可能是由于鞘质代谢途径的紊乱使得这些抗性信号的产生和防御结构的合成受到推迟和减弱,从而降低了acd5突变体的整体抗性。


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