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《中山大学》 2017年
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无色杆菌HZ01降解石油烃和合成生物表面活性剂的遗传基础

洪跃辉  
【摘要】:石油污染是严重的环境污染问题。微生物修复法已成为石油污染修复最可靠的方法之一,全面剖析降烃微生物的遗传背景有助于设计出高效修复石油污染的方法。生物表面活性剂应用广泛,揭示微生物合成表面活性剂的遗传基础对实现异源表达和低成本制备至关重要。前人发现无色杆菌HZ01能降解石油烃和合成生物表面活性剂,并对其降解石油烃的转录组(转录组#1)进行了初步分析,但目前对降烃途径和某些关键功能基因未予明晰,其基因组序列仍未被测定。本文以菌株HZ01为研究对象,深入分析了其转录组#1,进行了全基因组和转录组#2(关于生物表面活性剂合成的转录组)的测序分析,并对部分功能基因进行了验证。获得的主要创新性成果如下:(1)在转录组#1中,对转录调节、渗透压调节、应激反应、DNA损伤修复和差异表达显著的基因进行了分析,发现石油处理16 h会导致菌株HZ01中多个基因的转录水平发生改变。YhbH(可降低翻译效率)和CotE(与芽孢形成有关)表达显著上调以及某些重要结构蛋白的编码基因表达显著下调表明石油处理16 h对菌株HZ01产生了局部毒性。(2)获得了菌株HZ01的基因组草图序列(5532918 bp),预测出5162个基因,鉴定出大量与次级代谢产物合成相关的基因(包括基因簇terpene、phosphonate、siderophore、t1pks、arylpolyene、resorcinol和ectoine)。碳源利用实验表明,该菌株不能以部分常见的碳水化合物为唯一碳源,原因是与碳水化合物转运相关的基因量较少以及缺少某些与糖代谢相关的重要酶基因。纸片扩散法药敏实验显示,该菌株对头孢菌素类、氨基糖甙类、多肽类和碳青霉烯类抗生素耐药,并从其基因组中鉴定出耐药基因、毒力基因及与致病性相关的II、VI型分泌系统。(3)菌株HZ01以柠檬酸为唯一碳源时,其发酵液具有良好的乳化活性,表明发酵液中存在生物表面活性剂,其乳化作用可促进该菌株降解石油烃。菌株HZ01大量与石油烃降解直接相关的蛋白,不AlkB羟化酶及其同源物;该菌株拥有正构烷烃端氧化途径的完整酶系,参与邻苯二酚途径的基因较齐全,缺少部分甲烷氧化的必需酶,不次端氧化途径和环烷烃降解的Baeyer-Villiger单加氧酶,表明该菌株通过端氧化途径降解正构烷烃,主要利用邻苯二酚途径降解芳香族化合物,不能进行甲烷氧化和环烷烃降解。石油处理16 h导致其三羧酸循环途径被抑制,激活了端氧化途径的以下步骤:正构烷烃的起始氧化;脱氢酶、脂肪酸羟化酶和酰基辅酶A合成酶催化的反应;脂肪酸β-氧化。(4)在转录组#2中鉴定出5028个转录本;对差异表达显著的基因、ABC转运蛋白、双组分系统和三羧酸循环途径进行了分析。荧光定量PCR实验表明,转录组#2的基因差异表达分析准确,结果可靠。(5)以下蛋白的编码基因至少在两次测序分析中被鉴定出:Lux R家族转录调控因子、3-oxoacyl-ACP reductase、acyltransferase、OmpA、thioesterase、glycosyltransferase、3-oxoacyl-ACP合成酶,它们极有可能参与菌株HZ01的生物表面活性剂合成;完整的乙醛酸循环途径可能与该菌株的糖脂类表面活性剂合成有关;该细菌中与生物表面活性剂合成相关的基因不是以基因簇形式存在。
【学位授予单位】:中山大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:X172;Q78

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