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《中山大学》 2019年
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ERα对斑马鱼卵巢功能维持和Vtg生成的调控机制研究

陈煜  
【摘要】:雌激素在脊椎动物的雌性生殖中起着重要的作用。雌激素的生物学功能是通过雌激素受体(ERs)发挥的。雌激素受体是一类配体依赖的细胞核转录因子。在哺乳动物中,越来越多的证据表明ERα在雌性生殖中具有重要功能。然而,雌激素/ERα信号系统在鱼类雌性生殖中的生理学功能和作用机制仍然不清楚。在本研究中,利用TALEN基因编辑技术,我们敲除了斑马鱼中的ERα(esr1),并建立了基因突变斑马鱼品系。在此基础上,我们研究了ERα在鱼类卵巢功能维持和卵黄蛋白原生成调控过程中的功能及其作用机制。本研究的主要研究结果总结如下。1.ERα(esr1)突变斑马鱼品系的建立基于TALEN技术原理,我们在斑马鱼esr1基因第三外显子上设计了TALENs结合位点。对P0代斑马鱼的基因型检测发现,突变率达到50%(9/18)。在esr1基因第三外显子上,检测到一段8 bp的碱基缺失。这将导致该基因开放阅读框(ORF)的移码突变以及蛋白翻译的提前终止。2.生殖能力跟踪研究对雌性esr1突变斑马鱼的生殖能力追踪研究发现,在受精后90天时,这些雌性斑马鱼可育。并且值得注意的是,这些斑马鱼的产卵量显著高于相同年龄的野生型斑马鱼。但随着年龄增长,部分斑马鱼的生殖能力开始受到影响。在受精后105天时,可育的斑马鱼数量开始下降。当年龄到达受精后180天时,所有的雌性esr1突变斑马鱼均不育。3.雌性esr1突变斑马鱼形态学和卵巢组织学结构斑马鱼esr1基因敲除并没有改变各年龄段雌性斑马鱼的体长。雌性esr1突变斑马鱼的体重在受精后90天时显著高于野生型斑马鱼。且性腺指数(GSI)在受精后60和90天时也显著高于野生型斑马鱼。但是,雌性esr1突变斑马鱼的体重和性腺指数在受精后180天时显著下降,且显著低于相同年龄的野生型斑马鱼。卵巢组织学分析发现,在受精后60和90天时,雌性esr1突变斑马鱼的卵巢发育情况与野生型斑马鱼类似。所有发育时期的卵泡均有存在。然而到了受精后120天时,部分esr1突变斑马鱼的卵巢出现退化的情况。且在受精后180天时,所有esr1突变斑马鱼的卵巢都退化了,卵巢中仅有少量PG期和PV期卵泡以及部分闭锁卵泡存在。4.雌性esr1突变斑马鱼中类固醇激素合成调控Western blot分析发现,雌性esr1突变斑马鱼垂体中FSHb和LHb在受精后90天时与野生型斑马鱼相比无显著变化。但是在受精后180天时,FSHb和LHb的水平显著下降且低于野生型中水平。在受精后90天时,雌二醇(E_2)水平显著上调,11-酮基睾酮(11-KT)的水平在与野生型斑马鱼相比同样无显著性差异。但在受精后180天时,两种激素的水平均显著下降。RT-PCR分析发现,类固醇合成相关基因,包括star,hsd17b1,hsd17b3,cyp19a1a和fshr在受精后90天时显著上调,但在180天时显著下调。5.雌性esr1突变斑马鱼中IGF系统和mTOR信号通路RT-PCR分析发现,在受精后90天时,雌性esr1突变斑马鱼中mTOR信号通路的抑制因子tsc的表达水平显著下调。而mTOR信号通路中相关激酶和转录因子的表达水平剧烈上调。此外,IGF的表达水平也存在上调的情况。但是,在受精后180天时,IGF系统和mTOR信号通路相关基因的表达水平均剧烈下调。这说明雌性esr1突变斑马鱼卵巢功能的退化可能与IGF系统和mTOR信号通路相关。6.抑制mTOR信号通路导致斑马鱼卵巢功能退化为探究斑马鱼卵巢功能退化与mTOR信号通路的关系,我们用mTOR的抑制剂雷帕霉素对野生型雌性斑马鱼进行浸泡处理。14天后,我们发现这些雌性斑马鱼不育,性腺指数显著下降。组织学分析发现,雷帕霉素处理的雌鱼卵巢严重退化。MV,LV和FG期的卵泡消失不见,只剩下PG和PV期卵泡和一部分闭锁卵泡。7.雌性esr1突变斑马鱼卵泡的卵黄积累正常情况下,LV期的卵泡中应该充满卵黄颗粒。而FG期的卵泡中,卵黄颗粒粗大饱满,充满整个细胞。但是我们发现,在雌性esr1突变斑马鱼的LV期卵泡中,卵黄颗粒仅存在于卵母细胞的外周部分,并没有充满整个卵母细胞。除此以外,FG期卵泡中,大颗粒的卵黄颗粒数量非常少。大部分卵黄颗粒非常小。这说明,esr1突变可能导致斑马鱼卵黄生成和积累受阻。8.两种品系斑马鱼肝脏中雌激素受体和Vtg基因表达谱我们选取雄性斑马鱼作为研究卵黄蛋白原生成调控的模型。在雄性野生型和esr1突变斑马鱼肝脏中,esr2a的表达水平显著高于其他受体。敲除esr1并没有改变esr2a的表达水平,且使esr2b的表达水平下调。有趣的是,敲除esr1导致gper的表达水平显著上调。此外,vtg1是斑马鱼中最主要且表达量最高的Vtg。但在esr1突变斑马鱼中,vtg1的表达水平显著下降,但vtg2和vtg3的表达无显著变化。9.斑马鱼雌激素核受体(nER)对gper的调控作用在野生型斑马鱼中,E_2在离体和在体条件下均显著上调了esr1的表达。离体条件下,E_2处理没有改变esr2a和esr2b的表达水平。但是,在体条件下,esr2a和esr2b的表达水平在E_2处理后显著下调。当进行E_2处理时,gper的表达量无论在离体条件下还是在体条件下均显著上调,不仅如此,当ICI与E_2同时存在时,gper的表达量与E_2单独处理时无显著性差异,说明ICI无法抑制E_2对gper的促进作用。在esr1敲除斑马鱼中,我们仅对esr2a、esr2b和gper的表达水平进行了检测。这三个基因对药物处理的响应情况与野生型斑马鱼中相似。在野生型斑马鱼中,离体条件下PPT能显著上调esr1的表达水平,但是对gper的表达无显著影响。然而,在体条件下,PPT处理对esr1和gper均有显著上调作用。在esr1敲除斑马鱼中,离体条件下,PPT处理没有显著性改变gper的表达水平。有趣的是,在体条件下,PPT处理下调了gper的表达,这与野生型斑马鱼中的情况相反。10.斑马鱼GPER对雌激素核受体(nERs)的调控作用在野生型斑马鱼中,离体条件下G-1处理没有改变esr1、esr2a和esr2b的表达水平。但是,在体条件下G-1处理导致了esr1和esr2b的显著上调,以及esr2a的显著下调。在esr1敲除斑马鱼中,我们仅对esr2a和esr2b的表达水平进行了检测。G-1处理后,esr2a的表达水平在离体和在体条件下均呈现显著性下调。而esr2b的表达水平在离体条件下无显著差异,在在体条件下显著上调。11.斑马鱼雌激素核受体(nERs)调控卵黄蛋白原生成的作用机制在野生型斑马鱼中,E_2处理均显著上调Vtg基因的表达水平。然而,当ICI和E_2联合处理时,在离体条件和在体条件下,E_2对Vtg基因的刺激作用均被ICI显著抑制。在esr1敲除斑马鱼中,vtg1和vtg3的表达在受到E_2刺激时显著上调。当ICI和E_2联合处理时,离体条件下,E_2对vtg3的上调作用被显著减弱,而对vtg1的作用不受影响。在体条件下,E_2对vtg1和vtg3上调作用被ICI完全废除,vtg1和vtg3的表达水平与本底水平持平。有意思的是,在esr1敲除斑马鱼中,vtg2的表达水平不受E_2的调控。PPT处理显著上调了野生型斑马鱼离体条件下vtg1的表达,但vtg2和vtg3的表达水平没有改变。在体条件下,Vtg基因的表达水平均显著上调。在esr1敲除斑马鱼中,离体条件下,PPT处理显著上调了vtg1的表达水平,但没有改变vtg2和vtg3的表达水平。在体条件下,vtg1的表达水平显著上调,但vtg2和vtg3的表达水平显著下调。12.斑马鱼GPER调控卵黄蛋白原生成的作用机制在野生型斑马鱼中,G-1处理显著上调了Vtg基因的表达水平。当E_2与G-15联合处理时,离体条件和在体条件下,E_2对Vtg基因刺激作用均被G-15显著减弱。在esr1敲除斑马鱼中,情况与野生型斑马鱼中相似。ICI单独处理导致了野生型斑马鱼中Vtg基因表达水平的剧烈下调,但对esr1敲除斑马鱼中Vtg基因表达水平无影响。有趣的是,当ICI与G-1联合处理时,vtg1、vtg2和vtg3的表达量在野生型和esr1敲除斑马鱼中与ICI单独处理组相比都有显著性上升。这说明GPER可以直接调控Vtg基因表达。
【学位授予单位】:中山大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S917.4

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