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《中山大学》 2010年
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FoxO3基因在斑马鱼胚胎神经发育中的功能研究

彭扣  
【摘要】: 胚胎发育过程中,神经发育是一个很复杂的事件,包括各种信号传导的相互作用。本课题以斑马鱼的胚胎发育系统作为模型,采用“功能缺失”和“功能获得”的方法初步研究了FoxO3在胚胎神经发育过程的功能作用。 FoxO3是叉头盒(forkhead)转录因子中O亚家族成员,在生物体内参与多种生理调控作用,包括糖代谢、细胞增殖、细胞周期阻滞、压力耐受性、生物长寿控制及细胞凋亡等。然而,并不清楚其是否参与胚胎神经发育。 首先,通过RT-PCR、整胚原位杂交及免疫组化方法检测了斑马鱼FoxO3a基因的组织表达特征及胚胎发育时期的时空表达方式。结果显示:FoxO3a在斑马鱼成体组织如脑、眼、肝、鳃、卵巢、精巢、肠、心脏、脾脏都有表达而在肌肉和鳔不能或极微弱表达;在胚胎发育时期中,FoxO3a的转录本最早出现于卵裂早期(1-8细胞期),随后在囊胚晚期(4 hpf)上升到较高水平,且在受精后4-8小时间保持一个较高的表达。其后,表达逐渐下降并维持一个相对较低水平;为了确定FoxO3a在胚胎中的表达部位,进行了不同发育时期的胚胎整胚原位杂交和免疫组化实验,结果显示:FoxO3a主要集中在神经系统中表达,尤其在前脑、中脑、中后脑边界、后脑及视网膜部位表达更加明显。 采用反义morpholino(MO)敲降技术,斑马鱼FoxO3a被8ng FoxO3a-MO的敲降可引起胚胎神经发育的缺陷,且异常可被FoxO3a mRNA显微注射挽救。通过吖啶橙(acridine orange,AO)和TUNEL检测进一步证明FoxO3a的敲降诱导了一个增加的神经凋亡;采用荧光定量PCR和胚胎原位杂交方法进一步检测发现:FoxO3a的敲降导致胚胎发育晚期神经分子标志物表达下调且改变了凋亡相关分子的表达。 为了进一步研究FoxO3a调控胚胎神经发育的分子机制,构建了FoxO3a-A3突变体(将可能受PI3k/Akt信号磷酸化调控的三个保守的Ser/Thr位点分别用Ala替换)。比较分析了过量表达FoxO3a-A3突变体mRNA与FoxO3a mRNA后的胚胎发育表型,结果显示,400 pg FoxO3a-A3 mRNA显微注射后的胚胎死亡数目高于同剂量FoxO3a mRNA注射对照组。 对脊椎动物FoxO家族蛋白同源进化分析表明:在斑马鱼中存在两个与哺乳动物FoxO3a同源的蛋白(FoxO3a与FoxO3b)。因此,还检测了斑马鱼FoxO3b胚胎时空表达模式,结果显示,FoxO3b与FoxO3a都集中在神经系统部位表达。 对FoxO3b进行反义MO敲降,结果表明,6 ng FoxO3b-MO注射引起相似于FoxO3a敲低后的表型异常。最后,当共注射FoxO3b-MO与FoxO3a-MO时,则仅需4 ng混合MOs(2ng Foxo3a-MO +2 ng Foxo3b-MO)导致胚胎神经发育缺陷。进而通过荧光定量PCR法进一步检测发现FoxO3a与FoxO3b共敲降后显著抑制了神经分子标志物的表达,且诱导了凋亡基因Bim的强烈表达。最后,采用Western blot检测了FoxO3a与FoxO3b共阻断后Akt信号通路的变化,结果显示,斑马鱼FoxO3的抑制反馈激活了Akt信号通路,引起Akt磷酸化水平的升高。 这些发现,首次在生物体内证明了FoxO3基因是维持斑马鱼胚胎神经发育所必需的基因。
【学位授予单位】:中山大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q344

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【参考文献】
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