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《暨南大学》 2010年
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腺病毒介导hPDGF-BB转染表皮干细胞对其体外细胞增殖的实验研究

李新平  
【摘要】:目的:(1)构建人血小板源性生长因子hPDGF-BB基因腺病毒表达载体; (2)观察hPDGF-BB腺病毒表达载体修饰对hESCs增殖的影响。 方法:(1)通过PCR方法合成PDGF-BB,与pAD-track-CMV质粒连接后构建穿梭质粒pAD-PDGF-BB, pAD-PDGF-BB进行测序,检测PDGF-BB序列;取骨架质粒pAD-easy I和穿梭质粒pAD-PDGF-BB在BJ5183细菌中进行同源重组获得阳性重组子rad-PDGF, Pac I限制性内切酶切鉴定rad-PDGF,0.8%琼脂糖凝胶电泳检测;用lipofectaminTM 2000脂质体将rad-PDGF导入HEK293细胞,细胞出毒后将细胞反复冻融3次,高速离心收集上清液作为第一代病毒,检测其病毒滴度,PCR鉴定rad-PDGF携带目的片段PDGF-BB后进行病毒扩增与纯化。 (2)取健康青年人包皮来源的表皮干细胞(hESCs)作为靶细胞,体外分离和纯化hESCs,用免疫组织化学法检测表皮干细胞表达K19情况;用hPDGF-BB腺病毒表达载体(rad-PDGF)修饰表皮干细胞后,荧光显微镜观察修饰后的hESCs荧光蛋白表达情况,Western blot分析PDGF-BB的表达,用MTT法检测细胞增殖情况,并进行统计学分析。 结果:(1)PDGF-BB cDNA成功连接到穿梭载体pAD-track-CMV上,DNA测序结果与Genebank上PDGF-BB基因CDS区完全一致;rad-PDGF经Pac I限制性内切酶切可分离出一条为4.5kbp特异性大小的基因片段;包装成功的腺病毒颗粒,其病毒滴度可达到1×109pfu/ml,通过PCR方法可以获得大小为744bp大小的基因片段。 (2)分离后的表皮干细胞表达K19;在荧光显微镜下观察约85%的rad-PDGF修饰后的hESCs有绿色荧光蛋白表达;rad-PDGF修饰的hESCs可表达hPDGF-BB蛋白;与对照组相比较,rad-PDGF修饰促进了hESCs增殖(P0.05)。 结论:(1)通过细菌BJ5183同源重组的方法成功构建PDGF-BB重组腺病毒表达载体rad-PDGF; (2) rad-PDGF能高效的导入hESCs中,并能在hESCs表达hPDGF-BB蛋白,rad-PDGF修饰促进了hESCs的增殖。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R329

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