新靶向抗肿瘤候选化合物Z-GP-Dox的早期药代动力学研究

【摘要】：研究背景与目的： Z-GP-Dox是由本课题组前期自行设计合成的一种新型FAPa酶激活式靶向抗肿瘤候选化合物,由FAPa特异性酶底物N-苄氧基羰基-GP(Z-GP)的羧基与阿霉素(Dox)结构中的游离氨基通过酰胺键偶联而成。前期动物实验证实,Z-GP-Dox能靶向富集于肿瘤组织,通过释放母体药物Dox发挥高效低毒的抗肿瘤作用。该新型候选化合物在国家“重大新药创制”科技重大专项“十一五”计划项目支持下已进入成药性研究阶段。Z-GP-Dox早期药代动力学研究是其系统成药性研究的重要组成部分,旨在通过了解Z-GP-Dox在大鼠体内血药浓度的经时变化规律、求算Z-GP-Dox的主要药物动力学参数、考察Z-GP-Dox在体内各脏器组织中分布及血浆蛋白结合特征,阐明Z-GP-Dox在动物体内的动态变化规律及特点,为该新候选化合物的成药性评价提供必要的药代动力学依据。 研究方法： 1.生物样品中Z-GP-Dox分析方法的建立 通过遴选适合的萃取剂、流动相、检测条件等,建立HPLC-荧光检测器法测定大鼠血浆及各脏器组织等生物样品中Z-GP-Dox的含量。经比较甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷及按照不同比例配比的混合溶液对Z-GP-Dox的萃取回收率,确定乙腈-二氯甲烷(1：4)为萃取剂。在参考相关文献以及自行条件摸索后,确定色谱条件,即流动相：乙腈-0.1%TFA水溶液(2：3)。流速：1mL/min,柱温：25℃。经三维荧光检测器全波长扫描,确定检测激发波长为238nm,发射波长为554nm。 2. Z-GP-Dox在大鼠体内血药浓度测定和药动学参数求取 1)对Z-GP-Dox溶解溶剂、给药剂量、取血时间点等条件的探索 通过比较Z-GP-Dox在DMSO、甲醇、丙二醇等溶剂中的溶解度及各溶剂对动物的毒副作用后,本实验选择丙二醇作为Z-GP-Dox的给药溶剂。同时,综合考虑Z-GP-Dox体内药效学研究的有效剂量及其在丙二醇中的最大溶解度,动物使用丙二醇的最大安全用量等因素,本实验设置的Z-GP-Dox高、中、低三个给药剂量,即为20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg。根据前期预实验观察,给药后5h, Z-GP-Dox血药浓度已低于本检测方法的定量限,故确定于给药后3min、6min、10min、15min、20min、30min、40min、1h、1.5h、2h、3h、5h等12个时间点采集含药血浆样品。在参考Dox药代动力学研究相关文献的基础上, 本实验选用柔红霉素(DNR)作为Z-GP-Dox含量测定的内标。 2)给药取样并检测 通过单次颈静脉注射Z-GP-Dox(剂量分别为：20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg),于给药后3min、6min、10min、15min、20min、30min、40min、1h、1.5h、2h、3h、5h采取全血0.5m1,离心后得到含药血浆。利用所建立的HPLC检测方法,测定不同时间点血浆中Z-GP-Dox的浓度,绘制血药浓度-时间曲线,采用非房室模型计算Z-GP-Dox相关药代动力学参数。 3. Z-GP-Dox在小鼠体内组织分布特征研究 单次尾静脉注射20mg/kg Z-GP-Dox于昆明小鼠体内,并于给药后10min、20min、30min、1h、2h、3h处死小鼠。立即取心、肝、脾、肺、肾等脏器,并用生理盐水冲净表面残血及内容物,滤纸吸干,称重。用磷酸盐缓冲溶液将各脏器组织研磨成匀浆,按血浆样品方法萃取组织匀浆中的Z-GP-Dox, HPLC法测定各组织中Z-GP-Dox含量。 4. Z-GP-Dox大鼠血浆蛋白结合特性的体外研究 采用体外平衡透析法测定Z-GP-Dox大鼠血浆蛋白结合率。根据20mg/kg Z-GP-Dox药时曲线求取的表观分布容积计算的单位体积血浆中Z-GP-Dox浓度,预设平衡透析测定系列Z-GP-Dox血浆浓度为：0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL。样品处理、色谱条件及检测条件同Z-GP-Dox血药浓度的测定。 结果与结论： 1.生物样品中Z-GP-Dox分析方法的建立 分别建立了相对简便、灵敏、专属性较强的Z-GP-Dox生物样品HPLC检测方法。可用于测定大鼠血浆及各重要脏器组织等生物样品中Z-GP-Dox浓度或含量检测。该方法主要步骤为：在用乙腈-二氯甲烷(1：4)萃取除去生物样品所含蛋白与其他内源性杂质后,用氮吹仪挥干萃取剂,用甲醇溶解萃取出的药物,过膜后检测。色谱分析采用Ultimate AQ-C18色谱柱(4.6×250mm,5μm,美国Welch公司),流动相：乙腈与三氟乙酸(TFA),流速：1mL/min,柱温25℃。通过Waters515泵、717自动进样器进样20μL,采用2475检测器进行检测,激发波长为238nm,发射波长为554nm,内标：DNR。方法学验证结果表明,本实验所建立的Z-GP-Dox生物样品分析方法样品回收率83%,精密度12%。并且,生物样品中的内源性物质不干扰样品测定。提示本研究建立的生物样品中Z-GP-Dox分析方法符合新药(西药)临床前研究指导原则对新药临床前研究的要求,基本适用于Z-GP-Dox非临床药代动力学研究。 2. Z-GP-Dox在大鼠体内血药浓度测定和药动学参数求取 结果表明,在10～20mg/kg剂量范围内,Z-GP-Dox在大鼠体内分布转运过程基本符合线性动力学特征。分别单次静脉注射10mg/kg和20mg/kg Z-GP-Dox后,Z-GP-Dox在大鼠血液循环中的C3min、AUC0-t随剂量增加而增加,其C3min分别为5.63mg/L、19.56mg/L;AUC0-t分别为1.8mg/L×h、7.5mg/L×h; K、Vd、t1/2、MRT均不随给药剂量增加而发生显著性改变,其K分别为0.37、0.43；Vd分别为4.93L/kg、4.1L/kg; t1/2分别为1.9h、1.65h; MRT分别为0.84h、1.3h。但单次静脉注射低剂量(5mg/kg) Z-GP-Dox后,因血药浓度过低,所能测得的时间点过少(给药90min后所测得血药浓度已低于检测限),加之在低浓度下测定误差较大,其检测数据无法参与计算。 在本色谱检测条件下,母药Dox的保留时间为4min。据此,本实验同步考察了高、中、低三个剂量Z-GP-Dox在各时间点血浆样品中Dox的释放情况,结果未观察到有Dox代表峰存在。 3. Z-GP-Dox在小鼠体内组织分布特征研究 本实验考察了Z-GP-Dox在小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器的分布情况。结果表明,Z-GP-Dox在体内能快速分布到肺、脾、肾、肝、心等脏器。在给药后10-180 min内,单位重量组织中Z-GP-Dox含量高低依次为肺脾肾肝心。尤其值得注意的是,Z-GP-Dox在Dox重要毒性靶器官心脏的分布明显减少。而在此期间,心、肝、脾、肺、肾等脏器组织在本实验条件下均未检测到母药Dox,提示Z-GP-Dox在各组织器官内结构稳定,其母药Dox未因非特性水解而释放。但给药后1h开始,分别在肝脏和肾脏组织样品色谱图中均可见一新的色谱峰,保留时间约为13min,其结构尚待确定。但据其保留时间初步推测,该峰不属于Dox的代表峰,而可能是Z-GP-Dox的疑似代谢产物峰。由此初步认为,肝脏和肾脏可能是Z-GP-Dox的重要代谢器官。 4. Z-GP-Dox的血浆蛋白结合率 在本检测条件下,采用体外平衡透析法测得,在浓度为8μg/mL的血浆样品中,Z-GP-Dox的大鼠血浆蛋白结合率约为85%。