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《暨南大学》 2011年
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枯草芽孢杆菌ATCC 9372 Mn-SOD的克隆、表达与特性研究

赵怡  
【摘要】:为了实现SOD基因在大肠杆菌(E. coli)中的可溶性表达,根据枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)的sodA核酸序列设计引物,以枯草芽孢杆菌ATCC 9372的基因组DNA为模板,PCR扩增获得了SOD基因。分析表明此SOD基因编码的氨基酸序列与Bacillus属的纳豆枯草芽孢杆菌BEST 195(Bacillus subtilis natto BEST 195)和枯草芽抱杆菌168(Bacillus subtilis 168)的Mn-SOD序列具有较高的同源性。将此基因重组至原核表达载体pET28a,构建含SOD基因的重组表达质粒pET28a-SOD,并转化至大肠杆菌BL21 (DE3). IPTG诱导表达获得SOD融合蛋白,蛋白分子量约为26 kD,目的蛋白可溶性表达量高达45.6%。SOD融合蛋白纯化后,NBT活性负染色确定其为Mn-SOD.改良的连苯三酚自氧化法测定SOD活力,其比活高达2553.211 U/mg.Mn-SOD融合蛋白在pH 6.0-11.0范围内较为稳定,在pH 8.0左右具有最高酶活力。50℃处理90 min后,残余酶活仍有75%以上。利用荧光光谱分析法系统地研究了在不同pH、不同浓度变性剂盐酸胍或尿素存在时Mn-SOD融合蛋白构象的变化,并与酶活数据进行了对比。结果表明,酶活力的变化与荧光光谱所表现出来的蛋白质构象的变化几乎一致。为了证明Glu167对维持蛋白质空间结构有重要的作用,利用定点突变技术改变Glu167的密码子,制备突变体SOD [E167A]融合蛋白。与SOD融合蛋白相比,SOD [E167A]融合蛋白在335 nm处的荧光强度明显增大且荧光光谱发射波长发生了红移,说明SOD [E167A]融合蛋白的空间结构已经发生变化。SOD [E167A]融合蛋白的酶活仅有74.989 U/mg,为非突变体的2.94%,其热稳定性和抵抗盐酸胍的能力都明显降低,说明Glu167对酶活及维持蛋白空间结构稳定性具有重要的贡献。枯草芽孢杆菌ATCC 9372 Mn-SOD的制备与特性研究为阐明其结构与功能以及进一步探索Mn-SOD的简便高效的生产方法奠定了基础,具有重要的理论和现实意义。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q78

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【参考文献】
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