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《暨南大学》 2011年
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中药臭灵丹中HTMF体外抗肿瘤机制研究

曹长姝  
【摘要】:目的: 本研究观察分离自臭灵丹(Laggera pterodonta)中的3,5-二羟基-6,7,3',4'-四甲氧基黄酮(3,5-hydroxy-6,7,3',4'-tetramethoxyflavone, HTMF)体外抗肿瘤活性及对正常细胞的细胞毒性,对其诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制进行探讨,为将来开发抗肿瘤新药提供一些实验依据。 方法: 1 HTMF对正常细胞的细胞毒性及对肿瘤细胞增殖的影响 采用常规细胞培养方法,通过3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)法测定:HTMF对正常细胞(人脐静脉内皮细胞EVC304,非洲绿猴肾细胞Vero)的毒性,并计算出细胞的半数致死浓度CC50(50% Cytotoxicity Concentration)值;对肿瘤细胞(人肺癌细胞A549,肝癌细胞HepG2,喉表皮样癌细胞HEp-2和鼻咽癌细胞CNE)的增殖抑制率,并计算出细胞的半数致死浓度IC50 (50% Inhibitory Concentration)值;选择细胞增殖被显著抑制的肿瘤细胞(HEp-2和CNE)进行复筛,分析量效及时效关系;临床常用抗肿瘤药阿霉素(A driamycin, ADM)作为阳性对照,对HEp-2和CNE细胞的增殖抑制率:溶剂二甲亚砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)对HEp-2, CNE, EVC304和Vero细胞的毒性。 2 HTMF对肿瘤细胞、细胞核形态变化及对细胞凋亡率的影响 预处理组给予不同浓度的HTMF,采用倒置显微镜从形态学上观察各组细胞的形态变化并拍照;Hoechst 33258染色,荧光显微镜下观察细胞核形态变化并拍照。流式细胞仪检测(flow cytometry, FCM) HEp-2和CNE细胞凋亡率的改变。 3 HTMF对凋亡蛋白Caspase-3/Caspase-9的影响 采用Western-blotting法分别检测不同浓度HTMF处理组及同一浓度不同时间段处理组中凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (Caspase-3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)量的变化。 4 HTMF对线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,的影响 采用JC-1(一种广泛用于检测线粒体膜电位的荧光探针,通过荧光颜色的转变来观察线粒体膜电位的变化)染色,激光共聚焦显微镜下观察线粒体膜△Ψm的改变。罗丹明123(Rhodamine123,Rho123)染料染色,FCM检测线粒体膜AΨm值的变化。 结果: 1 MTT法结果显示HTMF作用48 h后A549、HepG2、HEp-2和CNE细胞的IC5o值分别为61.49、74.61、27.81和28.31μg/mL;EVC304和Vero细胞的CC50值分别56.49和87.64μg/mL。对HEp-2和CNE细胞进行复筛,发现其分别随着浓度和时间的增加细胞增殖抑制率增大,呈现剂量与效应及时间与效应双重依赖性关系(P 0.05, P 0.01). DMSO毒性结果显示不同实验组中所含不同体积分数的DMSO对HEp-2, CNE, EVC304和Vero细胞无细胞毒性(P0.05)。阿霉素对HEp-2和CNE细胞抑制活性优于HTMF。 2细胞形态改变显示HTMF作用于HEp-2和CNE细胞48 h后,随着浓度的升高细胞变圆,体积缩小,贴壁能力下降,同细胞对照组相比,其细胞数及细胞密度均明显下降。Hoechst33258染色观察显示随HTMF浓度的增加细胞出现核固缩,核体积变小,分布不均匀;部分细胞核出现碎裂,呈现致密蓝色颗粒状荧光的凋亡小体。流式细胞仪检测显示HTMF作用于HEp-2和CNE细胞后,随浓度的增加,细胞凋亡率显著性增加(P0.05,P0.01)。 3 Western-blotting法结果显示经不同浓度的HTMF处理HEp-2和CNE细胞后,呈浓度依赖性激活凋亡蛋白Caspase、Caspase-9;经40μg/mL浓度的HTMF处理后,随着时间的延长,细胞中Caspase-3、Caspase-9呈时间依赖性被激活。差异均具有统计学意义(P0.01)。 4 JC-1染色,激光共聚焦显微镜下观察显示荧光颜色分别随着浓度和时间的增加由红色向绿色转变,同时线粒体数目越来越少且分布变得越来越不均匀。Rho123染色,流式细胞仪检测结果显示线粒体膜△Ψm的平均荧光指数值分别随浓度及时间增加而下降(P0.05,P0.01)。 结论: 1 HTMF对HepG2, HEp-2, A549和CNE细胞均有不同程度的增殖抑制作用,其中对HEp-2和CNE细胞有显著性的抑增殖作用且呈现剂量、时间双重依赖性关系,而对正常细胞EVC304和Vero的细胞毒性相对较小。表明HTMF抗肿瘤具有选择性和相对高效低毒的特性。 2 HTMF可诱导细胞凋亡,显著抑制HEp-2和CNE细胞增殖,且细胞凋亡率呈浓度-效应依赖性关系。 3 HTMF诱导HEp-2和CNE细胞凋亡的通路中凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9呈浓度、时间双重依赖性被显著性激活。 4 HTMF可呈浓度和时间双重依赖性降低线粒体膜△Ψm,激活Caspase级联反应,通过线粒体途径诱导HEp-2和CNE细胞凋亡。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R285

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【参考文献】
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