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重组人成纤维细胞生长因子21的中试研究及其对非酒精性脂肪肝的治疗作用研究

张敏静  
【摘要】:成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21,FGF21)是成纤维细胞生长因子家族的新成员,是一种特异性作用于肝脏、胰岛、和脂肪组织的新型代谢调控因子。FGF21具有降低机体血糖血脂、改善胰岛素抵抗、保护胰岛β细胞等多种糖脂代谢调控的功能,因此,其在2型糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、脂肪肝等多种代谢综合症的临床应用方面极具潜力。 非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是以肝小叶内的肝实质细胞脂肪变性、炎性细胞浸润和脂肪沉积为主要病理表现,但无伴随过量饮酒史、病毒感染或其他病原体的一种代谢综合症,目前在临床上尚无特效的NAFLD治疗药物。动物模型研究结果表明,FGF21能够显著降低血清中甘油三脂、胆固醇以及低密度脂蛋白的含量,显示其具有治疗NAFLD的潜能。本研究首先利用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达可溶性重组人FGF21,并利用3T3-L1细胞测定重组蛋白的糖吸收活性。然后,通过建立NAFLD的动物模型,评估FGF21对NAFLD的治疗作用,并探讨其作用机制。 将含组氨酸标签的fgf21基因片段与大肠杆菌表达载体pET-3c连接后,获得重组表达质粒pET-fgf21并转化到宿主菌Origami B(DE3)中。最佳表达条件筛选结果显示,在20℃,1 mmol/L IPTG的条件下诱导20 h, rhFGF21表达量占菌体上清总蛋白的22.1%,且为可溶性表达。为了满足临床以及日常应用的需要,本研究对重组菌进行中试生产(50L)及纯化工艺研究。结果表明,以葡萄糖作为碳源,酵母提取物和蛋白胨作为氮源,并添加微量元素MgSO4 0.3 g/L, K2HPO4 2.5 g/L, KH2PO4 1.0 g/L, NaCl 4.0 g/L的培养基中,重组菌株的最佳生长温度为37℃,诱导温度为20℃,最佳溶氧含量30%,最佳诱导时间为细菌湿重达30g时,最佳诱导pH值为7.2~7.4。以此条件下,诱导20 h后,菌体湿重达到51.3g/L, rhFGF21可溶性表达量为33.4%。 采用Ni-NTA Sepharose和Sephadex S100联用的层析方法,可以获得纯度97%以上的rhFGF21,得率为213 mg/L。Western blot、精确分子量测定、HPLC及肽指纹图谱分析结果显示,本研究得到的rhFGF21序列与其它文献报道的一致。此外,纯化后的rhFGF21蛋白在含3%海藻糖的PBS中,即使在-20℃放置20周后仍未见明显降解和活性下降。这种保存方法有效解决FGF21的降解难题,并为日后重组蛋白的生产、运输以及应用提供重要的实验基础。 在细胞活性方面,rhFGF21对小鼠3T3-L1脂肪细胞具有显著的糖吸收促进作用,EC50为2.21 nM,与FGF21标准品比较无显著性差异。在另一方面,0.5μg/ml rhFGF21可持续显著上调小鼠3T3-L1脂肪细胞GLUT1 mRNA表达。此外,rhFGF21在0.125~32μg/ml的范围内对HepG2细胞无促增殖作用,但在0.25~4μg/ml的范围内对AKT抑制剂引起的存活抑制有拮抗效应。这个结果说明,纯化的rhFGF21具有促糖吸收活性,并能启动AKT途径,增加细胞活力。 建立高脂饮食喂饲的小鼠非酒精性脂肪肝模型,并利用rhFGF21对NAFLD进行治疗。结果显示,0.15mg/kg/d、0.5 mg/kg/d、1 mg/kg/d rhFGF21在给药10-20 d时均表现出显著的降低体重作用,而20-30 d后实验小鼠体重趋于稳定。各剂量rhFGF21处理组小鼠空腹胰岛素、空腹血糖和胰岛素稳态评价指数(HOMA-IR)均显著低于HFD模型组,表明rhFGF21可显著改善NAFLD小鼠的胰岛素抵抗水平。在肝功能以及血脂指标方面,各剂量rhFGF21处理组能显著降低小鼠血清中ALT、AST、ALP、TC、TG、HDL-C和LDL-C水平,说明rhFGF21能够改善NAFLD小鼠的肝功能,同时具有降血脂和肝脂效果。此外,与HFD模型组相比,各剂量rhFGF21处理组中肝组织的ROS含量显著降低,线粒体肿胀程度减轻,结构完整,肝细胞内脂滴蓄积大量减少,说明rhFGF21能够降低NAFLD小鼠肝脏的氧化应激水平,保护肝细胞线粒体的正常结构。 应用不同剂量rhFGF21给予NAFLD小鼠治疗后,病理分析显示,各处理组肝脏病理改变出现不同程度逆转,肝脏脂肪积蓄,炎症浸润和胶原纤维增生等病理变化显著缓解。 本研究还对rhFGF21治疗NAFLD小鼠的分子机制进行了探讨。结果表明,重组蛋白能显著上调NAFLD小鼠肝脏的SIRT1、SREBP-2、LDLR蛋白的表达,提示rhFGF21通过上调SIRT1的表达来抵御氧化应激,并通过上调肝细胞膜上的SREBP-2、LDLR表达,增加对血中胆固醇的摄取,降低血浆LDL水平,促进胆固醇的清除。此外,Q-PCR结果显不,rhFGF21能显著下调ACC1、ACC2、FAS、SCD1等脂肪代谢关键酶的mRNA表达,通过影响ACC-MA途径抑制脂肪合成,促进脂肪酸β氧化,减少肝脏TG蓄积。


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