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《暨南大学》 2016年
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罗非鱼(Oreochromis niloticus)无乳链球菌病早期免疫诊断技术及中草药防治产品研究

华亚南  
【摘要】:无乳链球菌是罗非鱼链球菌病的重要病原,抗生素和消毒剂虽然可以抑杀该菌,但药物残留不仅污染水环境,也危害消费者健康,因此,建立早期诊断技术,在链球菌病尚未出现典型症状时就及时发现,再使用安全有效的中草药复方防治该病,不仅易于治愈,还能保障水环境和水产品质量安全。本研究建立了快速检测无乳链球菌的间接竞争ELISA法,明确了罗非鱼感染链球菌数量与发病风险的关系,同时筛选出了有效中草药复方,阐明了该复方制剂的安全浓度及合适添加剂量,为防治罗非鱼链球菌病奠定了基础。本研究制备了抗无乳链球菌多克隆抗体,建立了检测无乳链球菌的间接竞争ELISA法,标准方程为:y=-17.138x+162.3,y代表竞争率(不同浓度标准品与抗原竞争一抗与无标准品竞争一抗时的OD450 nm值之比),x代表无乳链球菌不同浓度时的常用对数,相关系数R2=0.9979,最佳检测范围为9.6567×103~6.25×107 cfu·m L-1,最低检出限为9.6567×103cfu·m L-1,板内误差为5.02%,板间误差为7.38%。罗非鱼肝脏、脾脏和肾脏感染无乳链球菌的临界致病浓度为104 cfu·g-1。当罗非鱼肝脏、脾脏和肾脏感染菌量大于等于104 cfu·g-1时,罗非鱼出现典型链球菌病症状,并逐步死亡;当罗非鱼肝脏、脾脏和肾脏感染菌量小于104 cfu·g-1时,可通过自身免疫力清除病原菌,不出现症状。用230种中草药水提物进行体外抑杀无乳链球菌试验,筛选出了pH调至中性后抑菌效果较好的7种中草药,包括:五倍子、西青果、诃子、鸡血藤、水翁花、丹参和石榴皮。五倍子和西青果的抑菌效果最好,二者的MIC和MBC值均为12.5 mg·m L–1;诃子的MIC和MBC值均为50 mg·m L–1,鸡血藤、水翁花、丹参和石榴皮的MIC和MBC值均为100mg·m L–1。对上述有效的中草药进行联用药敏试验,结果显示,五倍子、西青果、水翁花、鸡血藤和石榴皮相互之间有协同作用;五倍子、诃子、鸡血藤、石榴皮、水翁花相互之间有协同作用;五倍子、西青果、诃子和石榴皮相互之间有协同作用。再根据单种中草药的抑菌效果、成本、毒性等因素组成了20种复方。通过体外抑菌试验发现中草药复方4、12和16效果相对更优,同时也可以抑杀罗非鱼的其它主要致病菌:海豚链球菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、创伤弧菌和维氏气单胞菌。急性毒性试验结果显示,中草药复方4在24、48和96 h的口服半致死浓度分别为927.668 mg·m L-1、854.577 mg·m L-1和626.512 mg·m L-1,安全浓度为217.56 mg·m L-1。中草药复方12在24、48和96 h的口服半致死浓度分别为2451.15 mg·mL-1、1750.71 mg·m L-1和1164.57 mg·m L-1,安全浓度为267.93 mg·m L-1;中草药复方16在24、48和96 h的口服半致死浓度分别为1062.25 mg·m L-1、913.00 mg·mL-1和676.21 mg·mL-1,安全浓度为202.33mg·m L-1。治疗试验结果显示,添加4%、2%和1%的中草药复方4的治愈率分别为80%,73.3%,66.7%;添加4%、2%和1%的中草药复方12的治愈率分别为93.3%,73.3%,70%;添加4%、2%和1%的中草药复方16的治愈率分别为80%、60%和40%;说明中草药复方4、12和16能够有效治疗罗非鱼无乳链球菌病,但是中草药复方12效果最好。中草药复方12对罗非鱼免疫功能的影响试验结果显示,与对照组相比,试验组罗非鱼增重率和增长率分别增加了36.99%和10.46%,红细胞数量先降低至6.6×109个/mL后升高;白细胞数量先升高至2.9×109个/mL后降低;白细胞分类计数中,淋巴细胞百分比先降低后升高;中性粒细胞和单核细胞百分比都是先升高后降低;血栓细胞百分比明显变化;28天后细胞都恢复至原水平。试验组罗非鱼体内溶菌酶和超氧化物歧化酶都显著升高,最高分别是对照组的1.35和1.26倍。总之,本研究建立了检测被感染罗非鱼早期的无乳链球菌数量的间接竞争ELISA技术,阐明了罗非鱼感染无乳链球菌的临界致病菌浓度为104 cfu·g-1;筛选出了抗无乳链球菌的中草药种类及复方12,明确了该复方的安全浓度和有效添加剂量,揭示了复方12促进罗非鱼生长和增强免疫抗无乳链球菌的作用。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S943

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