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《暨南大学》 2017年
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肠道病毒71型的检测与分型及人类巨细胞病毒包膜蛋白UL115原核表达与分离纯化

赖伟健  
【摘要】:1.2012年沙窝镇手足口病疫情中肠道病毒71型的检测与分型肠道病毒71型(EV71)感染人后通常会伴随手足口病的发生。在中国,每年有成千上万的儿童感染肠道病毒71型,该病毒严重影响公众的健康。研究肠道病毒71型的病毒学特性对预防与控制手足口病的爆发是十分关键的。本实验研究报道了2012年9月至10月期间湖北沙窝镇感染手足口病的105个患儿的情况。实验通过反转录PCR技术,荧光定量PCR技术,分离及培养病毒技术来检测病毒。对肠道病毒71型的VP1基因进行测序分析,同时构建系统进化树对肠道病毒71型进行基因分型。病例表明,多于90%的患儿小于9周岁,3-6周岁大的患儿比例占50%左右。患儿普遍感染肠道病毒71型,表明在沙窝镇爆发的手中口病大多数是肠道病毒71型的感染并引起相关的并发症。这些手足口病的病例中,有66位确诊是肠道病毒感染引起的,48位患儿被肠道病毒71型感染,另外,柯萨奇病毒A16型感染患儿数目达到16位。测序与进化树分析结果表明,沙窝镇出现的肠道病毒71型病毒株属于C4基因亚型。值得注意的是,沙窝与南昌的地理距离较远,而与武汉的地理距离较近,但是,系统进化分析显示沙窝出现的肠道病毒71型病毒株,与曾经爆发过手足口病的南昌的肠道病毒71型病毒株的遗传距离较为接近,但与同样曾经爆发过手足口病的武汉的肠道病毒71型病毒株的遗传距离较远。沙窝镇感染手足口病的患儿中,女患儿感染肠道病毒71型的比例较高。然而,曾经出现肠道病毒感染的武汉和南昌,男患儿感染肠道病毒71型的比例较高。通过该实验研究,加深了对肠道病毒的认识,特别是在中国引起流行性手足口病的肠道病毒。本实验对预防与控制肠道病毒的的爆发有很大的研究意义。2.人类巨细胞病毒包膜蛋白UL115原核表达与分离纯化人巨细胞病毒(HCMV),是感染人类的一种疱疹病毒。对于免疫系统发育不全和免疫抑制患者可引起相关病症,甚至致死。HCMV拥有20个以上的包膜蛋白,它们位于病毒的最外层,与病毒趋向性,吸附,融合,子代病毒包装,成熟,传播过程密切相关。了解清楚HCMV包膜蛋白的结构,生物学功能,可为病毒的生物学机制提供新的认识,加深病毒与宿主间关系的理解。同时提供新的思路去设计,研发抗人巨细胞病毒的相关药物,并且对病毒疫苗的研制,具有重要的研究基础和临床意义。UL115(g L)蛋白是包膜蛋白的其中一员,UL115包膜蛋白作为外来抗原,除了具有良好的免疫反应性外,还有免疫原性,可为制备相应的抗原诊断单克隆抗体和开发HCMV快速诊断试剂盒提供可选原料。因此,研究HCMV-UL115生物学功能对阐明HCMV致病机制及疫苗的研制是有重要价值的。本实验首先通过常规PCR技术克隆UL115基因,接着构建UL115克隆重组菌株以及重组表达菌株,成功表达带有组氨酸标签的UL115重组蛋白。经实验鉴定,该重组蛋白在原核细胞内,以包涵体形式表达。在此基础上,浅层摸索优化了表达菌株的表达条件。本实验的摸索的较好诱导表达重组蛋白的条件为:31℃,0.03 m M/L IPTG,诱导时间9 h。经过镍柱分离纯化,获得该重组蛋白。使用BCA法对初步纯化的UL115重组蛋白进行定量,该重组蛋白浓度可达到0.105μg/μl。本实验成功构建UL115重组蛋白原核表达体系,并且探索了表达体系表达条件,分离纯化后获得该重组蛋白。这为研究UL115蛋白单克隆抗体相关生物学功能打下基础,对诊断检测试剂盒和疫苗的研制有重要意义,同时也为其他包膜蛋白的原核表达提供了相关实验经验。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R725.1

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