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《暨南大学》 2017年
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AAPH诱导Ferroptosis影响鸡胚骨发育

万欣  
【摘要】:氧化应激是一种机体内氧化系统与抗氧化系统失衡的状态,是以氧化状态为主要形式。氧化应激无疑也会影响软骨细胞及破骨细胞生成、骨吸收及骨钙化等正常的骨生理与发育过程,也与骨质疏松、骨质增生及颈椎病等骨疾病及并发症相关。本课题关注于氧化应激对胚胎骨发育的影响,介于目前尚无成熟的相关实验模型,因而氧化应激影响胚胎骨发育的作用机制并不十分明确。本研究在前期工作的基础上,利用氮自由基供体-偶氮二异丁脒盐酸盐(AAPH)诱导的鸡胚慢性氧化应激模型,并基于该模型通过iTRAQ蛋白组学等实验技术,旨在筛选和发现氧化应激影响骨发育的相关通路及其作用机制。首先,我们采用鸡胚建立AAPH诱导的氧化应激模型,在胚胎发育时期(embryo development day:EDD)1.5、3.5、5.5或EDD 1.5、3.5、5.5、7.5、9.5分别通过蛋清给予鸡胚不同浓度的AAPH(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、10.00μmol/egg)模拟胚胎的氧化应激环境。当鸡胚孵育至EDD 7和EDD 17,记录死亡率、体重等指标,同时取鸡胚骨骼染色,观察鸡胚骨骼发育情况。实验通过对鸡胚骨骼固定、切片及染色等观察,发现AAPH可导致鸡胚死亡率上升、发育迟滞、胫骨长度变短以及增殖区长度变短等现象。我们对鸡胚胫骨的软骨组织SOD酶活性、MDA及GSH的含量测试结果显示鸡胚软骨组织处于严重的氧化应激状态,实验证明AAPH诱导的氧化应激能够显著引起骨损伤。基于建立的AAPH诱导的鸡胚氧化应激模型,及通过iTRAQ蛋白组学技术筛选发现氧化应激诱发骨发育障碍与软骨发生铁凋亡相关。本实验利用铁凋亡特异性抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)对该模型的影响进行研究。具体为在EDD 1.5、3.5、5.5、7.5、9.5时期通过蛋清给予鸡胚0.50μmol/egg AAPH及50 nmol/egg Fer-1,EDD 17时期取胚,记录死亡率、体重等指标。此外,实验通过骨骼染色观察鸡胚骨发育情况,HE染色后观察胫骨生长板的内部表征,检测铁凋亡相关物质的基因和蛋白含量。研究结果表明Fer-1可以逆转AAPH导致的短肢畸形,保护增殖区结构,抑制铁凋亡通路的激活。由于来源于小鼠畸胎癌株AT805的ATDC5细胞,属前软骨细胞株,其分化与软骨形成具有类似过程,本实验采用AAPH和铁凋亡触发剂Erastin在ATDC5细胞上建立铁凋亡实验模型,探讨铁凋亡抑制剂Fer-1对ATDC5细胞的抑制率、生长情况、脂质过氧化及铁凋亡相关基因蛋白等的影响,结果显示AAPH引起了细胞死亡,其死亡方式包括坏死性凋亡和铁凋亡。本研究结果不仅证明AAPH通过铁凋亡方式引起细胞死亡,而且发现铁凋亡抑制剂Fer-1能够有效的缓解AAPH引起的ATDC5细胞分化抑制,降低细胞脂质过氧化水平,和抑制铁凋亡通路。综上,我们利用鸡胚建立的AAPH诱导氧化应激模型,能够有效的用于评价氧化应激对骨发育的影响及探讨作用机制,实验证明氧化应激介导铁凋亡作用生长板增殖区细胞影响骨发育,本实验研究结果为临床改善氧化应激导致的子代骨发育异常提供了新的治疗思路及科学内涵。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R363

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