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《暨南大学》 2017年
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23-羟基白桦酸衍生物B4G2抗肝癌活性评价及作用机制研究

雷雨禾  
【摘要】:目的:研究23-羟基白桦酸衍生物B4G2对人肝癌细胞株HepG2的增殖抑制作用及其作用机制方法:(1)MTT法检测B4G2对四种肝癌细胞株的增殖抑制作用;(2)克隆形成实验检测B4G2对HepG2细胞的长期增殖抑制作用;(3)PI染色观察B4G2对HepG2细胞周期的影响;(4)Hoechst 33528染色实验观察核染色质的变化;(5)Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡率;(6)透射电镜观察细胞亚显微结构;(7)蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白caspase家族、PARP及Bcl-2家族的表达水平;(8)JC-1染色实验检测线粒体膜电位变化;(9)Fluo-3-AM染色检测细胞内钙离子水平;(10)H2DCFDA荧光探针检测ROS含量的变化;(11)MDC染色观察自噬小体;(12)Mito-tracker荧光探针定位线粒体;(13)ATP检测试剂盒检测细胞ATP水平结果:B4G2能较强地抑制HepG2、Hep3B、Bel-7402、HepG2/ADM四种肝癌细胞株的增殖,B4G2对HepG2的增殖抑制作用呈现剂量依赖性。对细胞周期的检测表明,随着给药浓度增加,HepG2细胞的SubG1凋亡峰逐渐累积。Hoechst 33528染色实验表明B4G2可以造成染色质凝集固缩。透射电镜观察细胞发现,B4G2给药后细胞在形态学上出现明显的凋亡现象。流式细胞仪检测Annexin V-FITC/PI染色的细胞显示,B4G2诱导细胞出现早期凋亡和晚期凋亡都呈现剂量依赖性。Western blot免疫印迹法检测凋亡关键蛋白,发现caspase3、caspase8、caspase9和PARP都有明显的剪切活化,但caspase的抑制剂Z-VAD-FMK不能逆转B4G2诱导的凋亡。JC-1染色显示,B4G2可造成线粒体膜电位去极化,进而引起凋亡前体蛋白细胞色素C透膜释放到胞浆中去。B4G2还可以促进细胞内ROS和钙离子水平的升高,抗氧化剂NAC可以抑制二者的升高,逆转线粒体膜电位的降低,拮抗B4G2诱导的凋亡。同时PT孔的抑制剂MgCl2也可以拮抗细胞凋亡。进一步研究表明,B4G2可以诱导细胞发生线粒体自噬,且自噬抑制剂可以使细胞凋亡率进一步升高。结论:B4G2对HepG2细胞具有较强的增殖抑制作用,其作用机制为:B4G2诱导了ROS的累积和钙依赖性PT孔的开放,从而诱导细胞发生线粒体凋亡。B4G2还可以诱导线粒体自噬,且自噬能拮抗凋亡,对细胞起保护作用。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R285

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