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《暨南大学》 2017年
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重组类人胶原蛋白的表达纯化及在化妆品中的应用

张卉  
【摘要】:目的:利用大肠杆菌系统表达重组类人胶原蛋白。优化中试发酵和纯化工艺,得到纯度90%以上的类人胶原蛋白,进行理化性质测定,建立体外活性测定方法检测蛋白活性。筛选类人胶原蛋白的稳定保护剂应用于精华液配方,并根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)技术要求,采用急性经皮毒性试验、皮肤变态反应试验、皮肤刺激性试验,测试其使用的安全性。方法:将编码重组类人胶原蛋白(hlcollagen)的DNA片段克隆到原核表达载体pET3c中,新构建并重组表达质粒pET3c-hlcollagen,将表达好的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,氨苄抗生素筛选法优选重组子。IPTG诱导表达,优化发酵条件,IPTG诱导表达,收集菌体,均质机破碎后通过NI柱亲和层析(Ni Sepharose 6 Fast Flow)和分子筛(Sephadex G-25)联用分离纯化得到重组类人胶原蛋白。针对hlcollagen对NIH/3T3细胞的促粘附活性,建立其活性测定方法。通过平行对比实验筛选并优化hlcollagen保护剂,并应用于重组蛋白原液和精华液的制备。采用急性经皮毒性试验、皮肤刺激性试验、皮肤变态反应试验,检测重组类人胶原蛋白在生物体内的安全性。结果:1、DNA测序结果显示,重组类人胶原融合蛋白的重组子pET3c-hlcollagen与源序列同源性比对匹配度100%,1 mM IPTG诱导4 h后,得到分子量约为26 kDa的重组类人胶原蛋白,表达量占菌体上清总蛋白的26%及以上。通过NI柱亲和层析方法可获得纯度大于93.5%的目的蛋白,平均表达量在300~500 mg/L发酵液之间。2、NIH/3T3细胞促粘附性结果显示:重组类人胶原蛋白有明显促细胞粘附活性,未见细胞毒性。3、保护剂原料筛选结果显示:0.5%的烷基糖苷,在常温下有利于使重组类人胶原蛋白的结构完整。4、将筛选出来保护剂原料应用于精华液的配方,开发了一款精华液产品。5、安全性评价试验结果显示重组类人胶原蛋白没有明显毒性及刺激性。急性经皮毒性试验未发现小鼠中毒或死亡的现象(安全剂量2.0 g/k g);皮肤刺激性试验中,小鼠新西兰兔皮肤给药部位没有出现皮肤刺激性的现象(10μg/cm2);变态反应的试验结果表明,重组类人胶原蛋白组(10μg/cm2)无论诱导接触还是激发接触均未观察到皮肤变态阳性反应和过敏反应。结论:本研究在大肠杆菌中高效表达了重组类人胶原蛋白,平均得率达到500 mg/L;经纯化鉴定,得到了稳定的重组类人胶原蛋白,并筛选出了烷基糖苷(0.5%)作为其最优的保护剂;重组类人胶原蛋白对NIH/3T3细胞有明显的促粘附活性,并以此为基础建立了活性测定方法;重组类人胶原蛋白对实验动物没有急性经皮毒性、皮肤刺激性极小、未发现变态反应;并通过工艺优选,研究开发了一款稳定的重组类人胶原蛋白精华液并应用于市场。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ658

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