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《暨南大学》 2017年
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TRIB3在肾透明细胞癌发生发展中的作用及机制探讨

衡宝利  
【摘要】:研究背景和意义肾细胞癌约占所有成人恶性肿瘤的2%~3%,其中肾透明细胞癌(Clear-cell renal cell carcinoma,ccRCC)最常见且恶性程度最高。目前,手术仍是局限性肾癌的首选治疗方案。免疫治疗与分子靶向药物治疗效果不明显。肾癌的发病机制仍不清楚,临床亟需疗效确切的靶向治疗药物,而对于新型基因的研究仍是较好的切入点。Tribbles(TRIBs)假激酶是细胞周期、分化、新陈代谢、增殖和细胞应激的基本调节因子。其包括3个成员:TRIB1、TRIB2和TRIB3。研究显示TRIBs极可能与肿瘤发生和致瘤性转化相关,研究其在肿瘤中的角色及机制,可能为肿瘤的诊治提供新思路。方法本研究首先通过转录组测序分析TRIB家族基因在ccRCC组织中的表达,并通过提取TCGA数据库中ccRCC患者RNA-seq数据进行分析验证,并进一步探讨TRIB家族基因mRNA表达与患者临床病理特征及预后的相关性。通过qRT-PCR、western-blot和免疫组织化学检测TRIB3在ccRCC中的表达,在肾癌细胞株(769-P细胞系)基础上应用si RNA技术沉默TRIB3基因,随后通过CCK-8、transwell迁移和侵袭、流式细胞术、RNA-seq等实验,探讨TRIB3基因在ccRCC中的功能及机制。Target Scan预测可能靶向调控TRIB3基因的miRNA,GEO Data Sets ncRNA芯片数据分析其在ccRCC中表达,荧光素酶报告基因实验探讨其与TRIB3基因的靶向作用关系。结果1.34对配对ccRCC及癌旁组织RNA-seq结果显示癌组织中TRIB2和TRIB3 mRNA表达显著上调,TRIB1 mRNA表达无显著统计学差异。2.TCGA 72对配对ccRCC及癌旁组织RNA-seq结果显示癌组织中TRIB1 mRNA表达显著下调,TRIB3 mRNA表达显著上调,TRIB2 mRNA表达无显著统计学差异。并在TCGA524例肾细胞癌组织及72例癌旁组织对结果进行验证。3.524例ccRCCRNA-seq结果分析显示TRIB1 mRNA表达与患者p T分期、远处转移、病理分期及个体带瘤情况显著相关。TRIB2 mRNA表达与患者性别、Fuhrman分级、远处转移、病理分期及个体带瘤情况显著相关。TRIB3 mRNA表达与患者性别、pT分期、Fuhrman分级、远处转移、病理分期、生存情况及个体目前带瘤情况显著相关。4.生存分析显示TRIB1和TRIB2 mRNA表达无明显预后诊断价值;TRIB3 mRNA高表达与ccRCC患者短的生存时间显著相关,低表达组平均生存时间86.42±3.49,高表达组平均生存时间55.80±2.38月。cox回归分析结果显示年龄≥60岁、缺乏新辅助治疗、高的Fuhrman分级、病理分期、个体带瘤情况及TRIB3 mRNA高表达为影响患者预后的风险因素。5.qRT-PCR及western-blot对配对临床样本检测显示ccRCC中TRIB3 mRNA和蛋白表达均显著高于癌旁组织。ccRCC免疫组织化学结果显示ccRCC组织中TRIB3蛋白表达于细胞核。6.qRT-PCR及western-blot检测显示TRIB3 mRNA及蛋白表达在肾癌A498、ACHN、Caki-1、Caki-2、769P细胞株中均显著高于正常人肾近端小管上皮细胞株HK-2。7.CCK-8、Transwell检测显示肾癌细胞株中沉默TRIB3显著抑制了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。8.western-blot和流式细胞术检测显示沉默TRIB3使促凋亡蛋白PARP、caspase-9和Bax表达上调,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达则下调,细胞凋亡率显著上调。9.RNA-seq结果显示沉默TRIB3基因后,543个基因表达有显著差异,其中195个基因表达上调,348个基因表达下调。KEGG pathway分析富集评分排在前5的分别是TNF信号通路,NF-κB信号通路,肿瘤micro RNAs,细胞因子-细胞因子受体相互关联通路和细胞凋亡通路。10.GEO Data Sets提取ncRNA芯片数据分析结果显示miR-124-3p在ccRCC组织中表达较癌旁组织显著下调。11.293T细胞中过表达miR-124-3p可以使TRIB3蛋白表达显著下调,而抑制miR-124-3p则使TRIB3蛋白表达显著上调。双荧光素酶报告基因结果显示野生型TRIB3 3′UTR共转染组过表达miR-124-3p显著抑制了荧光素酶活性,抑制miR-124-3p表达荧光素酶活性显著升高;突变型TRIB3 3′UTR共转染组结合位点均为未显示出明显的荧光素酶活性改变,说明TRIB3是miR-124-3p的直接靶向基因。结论:1.TRIB3在ccRCC组织中表达稳定上调,且与肿瘤恶性进程和不良预后显著相关。TRIB3的高表达是ccRCC患者不良预后的独立预测因子。2.沉默TRIB3基因表达可抑制肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进肾癌细胞凋亡。3.TRIB3可能通过抑制细胞凋亡并激活TNF信号通路、NF-κB信号通路影响ccRCC进程。4.miR-124-3p在ccRCC中显著低表达,其可能通过靶向调控TRIB3基因发挥抑癌作用。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R737.11

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