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《暨南大学》 2017年
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miR-218调控前列腺癌肿瘤干细胞干性及其分子机制研究

田焕书  
【摘要】:前列腺癌是一种严重威胁男性健康的恶性肿瘤,目前治疗前列腺癌的方法均未能达到理想的效果,而去势抵抗和肿瘤转移更是棘手问题,探讨前列腺癌的生物学特性、寻找潜在的治疗靶点可能为临床治疗开辟新途径。近年来研究表明,肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)在恶性肿瘤局部浸润和转移中起重要作用。肿瘤干细胞是肿瘤细胞的祖细胞,它们虽占肿瘤中极少部分,但具有类似于成体干细胞的自我更新能力和多分化潜能,是肿瘤发生、扩散、复发等过程的起始细胞,对肿瘤发生、维持肿瘤内稳态并使肿瘤的侵袭性增高进而出现转移起决定性的作用。miRNAs(micro RNAs)是一类内源性小型非编码RNA,被称为微小RNA,由大约22个核苷酸分子组成,通过与靶基因mRNA的3'UTR结合阻断靶基因mRNA的翻译,负性调控基因的表达。已被研究证实它们是在人类癌症的发生发展中起重要作用的调节分子。最新证据表明,miRNAs的异常表达与大量癌症疾病中的肿瘤干细胞失调有关。近年来miR-218的研究成为热点,其与肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤相关,在不同的肿瘤中调控的靶基因和功能也有不同的变化。RELN(reelin)是一种细胞外糖蛋白,是一个由3461个氨基酸组成对的细胞外基质蛋白,与神经元细胞和几种类型的非神经元细胞的定位和迁移相关。最新研究表明,在多发性骨髓瘤细胞中RELN高表达,且RELN高表达与骨髓瘤细胞预后不良有关。Reelin在细胞迁移和癌症转移中的作用在很大程度上尚不清楚,特别是在肿瘤干细胞(CSCs)中的作用尚不清楚。本课题组先前的研究显示,miR-218在前列腺癌组织中异常表达。然而,miR-218确切的作用机制尚不清楚,是否通过调节CSCs进而影响前列腺癌的生物学行为以及如何调控CSCs均未阐明。因此,深入探讨miR-218异常表达在前列腺癌干细胞中的作用,将有助于认识前列腺癌浸润、转移的生物学行为及其潜在机制,为前列腺癌的早期诊断及预后提供新的指标,同时也为前列腺癌的治疗提供新的治疗靶点。在本研究中,我们探讨miR-218通过调控下游靶基因RELN影响前列腺癌CSCs的干性。目的:(一)通过探讨miR-218在前列腺癌组织和前列腺癌干细胞中的表达情况,为进一步研究其在前列腺癌干细胞中的功能奠定基础。(二)探讨miR-218在CD44+/CD133+肿瘤干细胞PC-3CSCs中的作用。(三)研究miR-218和RELN对前列腺癌干细胞增殖和侵袭能力的影响,明确靶基因RELN的功能。方法:(一)通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测40例人体前列腺癌组织标本及其配对癌旁组织标本中miR-218的表达。(二)采用免疫磁珠法从无血清悬浮培养的前列腺癌细胞中分选CD44+/CD133+前列腺癌干细胞群和非干细胞群,通过流式细胞仪检测了两个细胞群中细胞纯度,并通过qRT-PCR检测了两个细胞群中miR-218的表达。(三)采用miR-218 mimics慢病毒转染前列腺癌干细胞PC-3 CSCs,qRT-PCR验证miR-218的表达。(四)通过MTT检测miR-218对PC-3 CSCs增殖能力的影响;平板克隆形成实验检测miR-218对PC-3 CSCs克隆形成能力的影响;肿瘤球形成实验检验肿瘤干细胞PC-3 CSCs自我更新能力;Transwell侵袭实验检测miR-218对PC-3 CSCs细胞迁移侵袭能力的影响;裸鼠皮下成瘤实验检测miR-218对PC-3 CSCs体内成瘤能力的影响。(五)通过TargetScan、picTar和miRnada靶基因预测软件筛选肿瘤迁移相关的靶基因;双荧光素酶基因报告载体系统间接验证miR-218下游靶基因RELN;Western blot直接验证经慢病毒转染miR-218 mimics和inhibitor后,细胞中RELN蛋白表达水平。(六)转染RELN过表达载体到miR-218过表达的miR-218 PC-3 CSCs细胞,通过MTT检测RELN对miR-218 PC-3 CSCs增殖能力的影响;平板克隆形成实验检测RELN对miR-218 PC-3 CSCs克隆形成能力的影响;Transwell侵袭实验检测RELN对miR-218 PC-3 CSCs细胞迁移侵袭能力的影响;裸鼠皮下成瘤实验检测RELN对miR-218 PC-3 CSCs体内成瘤能力的影响。结果:(一)组织样品qRT-PCR结果显示,前列腺癌组织中miR-218的表达显著低于癌旁组织标本(P0.05)。(二)流式检测结果表明,免疫磁珠分选法分选出的前列腺癌干细胞群中,CD44+/CD133+细胞达到98.2%,qRT-PCR检测结果表明,在前列腺癌干细胞中miR-218的表达降低,与非前列腺癌干细胞之间比较具有显著性差异(P0.05)。(三)qRT-PCR检测结果表明,转染miR-218 mimics细胞中miR-218的表达水平是对照miR-NC组的近20倍,差异具有统计学意义(p0.01)。(四)MTT实验结果显示,与miR-NC组比较,miR-218 mimics组细胞增殖能力显著降低(p0.01);平板克隆形成实验结果表明,与miR-NC组比较,miR-218 mimics组细胞克隆形成能力显著降低(p0.01);肿瘤球形成实验结果表明,与miR-NC组比较,miR-218 mimics组细胞肿瘤球成球能力显著降低(p0.01);Transwell侵袭实验结果表明,与miR-NC组比较,miR-218 mimics组细胞迁移侵袭能力显著降低(p0.01);裸鼠皮下成瘤实验结果表明,与miR-NC组比较,miR-218 mimics组细胞体内成瘤能力显著降低(p0.01)。(五)通过软件在线预测筛选RELN为miR-218新的下游靶基因;双荧光素酶报告基因实验结果显示,野生型组荧光强度显著降低,而突变组无明显变化;Western blot检测结果显示,对比miR-NC组,miR-218 mimics组细胞中RELN蛋白降低,miR-218 inhibitor组细胞中RELN蛋白明显升高。(六)MTT实验结果显示,与miR-218组比较,miR-218+RELN组细胞增殖能力显著升高(p0.01);平板克隆形成实验结果表明,与miR-218组比较,miR-218+RELN组细胞克隆形成能力显著升高(p0.01);Transwell侵袭实验结果表明,与miR-218组比较,miR-218+RELN组细胞迁移侵袭能力显著升高(p0.01);裸鼠皮下成瘤实验结果表明,与miR-218组比较,miR-218+RELN组细胞体内成瘤能力显著升高(p0.01)。结论:(一)免疫磁珠分选法可以成功的分选出前列腺癌干细胞。(二)miR-218在前列腺癌组织和前列腺癌干细胞中低表达。(三)miR-218可抑制PC-3 CSCs增殖能力、克隆形成能力、成球能力、侵袭能力和体内成瘤能力。miR-218抑制前列腺癌干细胞干性。(四)miR-218可以通过绑定RELN的3’UTR抑制RELN蛋白的表达。miR-218可以通过抑制RELN的表达调控前列腺癌干细胞干性。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R737.25

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