收藏本站
《暨南大学》 2017年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

金雀异黄素阻断IL-8/STAT3轴抑制TAM诱导卵巢癌干样细胞特性研究

宁映霞  
【摘要】:第一部分:SKOV3源性卵巢癌干样细胞和肿瘤相关巨噬细胞的制备与鉴别目的体外培养和扩增SKOV3源性卵巢癌干细胞样细胞(ovarian cancer stem-like cells,OCSLC,简称卵巢癌干样细胞)和THP-1源性肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAM),以利进行SKOV3源性OCSLC与THP-1源性TAM相互作用以及金雀异黄素干预作用机制的研究。方法用干细胞条件培养基超低粘附板悬浮培养法从建立人卵巢癌SKOV-3细胞系扩增球细胞,并通过比较SKOV-3细胞和SKOV-3细胞系第2代球细胞体外肿瘤球形成和琼脂集落形成能力、肿瘤干细胞标志物(CD133和CD44)蛋白表达以及裸鼠体内致瘤性,鉴别是否为SKOV3源性OCSLC。用佛波酯(PMA,100ng/ml)处理体外培养人单核细胞THP-1细胞48h,制备THP-1巨噬细胞。应用Transwell共培养细胞小室进行SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养,制备TAM细胞模型,并通过比较THP-1巨噬细胞和SKOV3源性OCSLC共培养THP-1巨噬细胞TAM标志物(CD68和CD163)蛋白表达、细胞因子(IL-8、IL-10、IL-12、IL-1β、VEGF、MMP-9)和NO产物浓度水平、鉴别SKOV3源性OCSLC共培养THP-1巨噬细胞是否为THP-1源性TAM。结果1.分散的原代SKOV3细胞系球细胞能够形成第2代球细胞,随后形成第3代和第4代球细胞;以SKOV3细胞系第2代球细胞在第3次球培养中得到的球形成效率最高(P0.05)。2.与SKOV3细胞比较,SKOV3细胞系第2代球细胞具有更高肿瘤球形成率、琼脂集落形成率、肿瘤干细胞标志物CD133和CD44蛋白表达水平(P0.05)。3.与SKOV3细胞比较,SKOV3源性OCSLC具有更强裸鼠体内致瘤性(P0.05)。4.与THP-1巨噬细胞比较,SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养THP-1巨噬细胞CD163、p-STAT3和NF-κBp65蛋白高表达(P0.05);然而,两者的CD68蛋白表达差异无统计学意义。5.与SKOV3源性OCSLC条件培养基(OCSLC-CM)和THP-1巨噬细胞条件培养基(THP-1-CM)相比,SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养条件培养基(Co-CM)的IL-8、IL-10、VEGF、MMP-9更高,IL-12浓度和NO产物浓度水平降低(P0.05);然而,THP-1-CM和Co-CM的IL-1β浓度水平的差异无统计学意义。6.与THP-1-CM处理SKOV3细胞比较,Co-CM处理诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达(P0.05)。7.SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共注射促进SKOV3源性OCSLC裸鼠移植瘤生长(P0.05)。小结1.SKOV3细胞系第2代球细胞具有OCSLC性质。2.SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养THP-1巨噬细胞具有TAM性质,并且SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共注射促进SKOV3源性OCSLC裸鼠移植瘤生长。第二部分:IL-8/STAT3参与TAM诱导SKOV3细胞OCSLC特性的作用目的研究SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养IL-8高分泌是否参与和促成SKOV3源性OCSLC与THP-1源性TAM相互作用诱导SKOV3细胞OCSLC特性的获得。方法采用蛋白质印迹、ELISA测定、肿瘤球形成和琼脂集落形成试验,分别检测在THP-1巨噬细胞条件培养基或干细胞条件培养基添加IL-8以及在SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养条件培养基免疫耗竭IL-8情况下THP-1巨噬细胞的TAM标志物(CD163)蛋白表达、细胞因子(IL-10和IL-12)和NO产物浓度水平以及SKOV3细胞肿瘤球形成率、琼脂集落形成率、肿瘤干细胞标志物CD133和CD44蛋白表达水平;以确定SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性获得作用是否依赖IL-8高分泌。结果1.添加IL-8的THP-1巨噬细胞条件培养基增高THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达水平和IL-10浓度水平(P0.05);同时,抑制THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成(P0.05)。2.添加IL-8的干细胞条件培养基诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达。3.添加IL-8的THP-1巨噬细胞条件培养基上调THP-1巨噬细胞p-STAT3和NF-κBp65蛋白表达。4.免疫耗竭IL-8的SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养条件培养基降低THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达水平和IL-10浓度水平(P0.05);同时,促进THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成(P0.05)。5.免疫耗竭IL-8的SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养条件培养基抑制诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达(P0.05)。6.免疫耗竭IL-8的SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养条件培养基抑制THP-1巨噬细胞STAT3蛋白磷酸化和下调NF-κBp65蛋白表达(P0.05)。小结SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性获得依赖于IL-8高分泌。第三部分:金雀异黄素对SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞OCSLC特性的影响目的确定金雀异黄素抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性获得作用。方法应用蛋白质印迹、ELISA测定、肿瘤球形成率测定和琼脂集落形成试验检测金雀异黄素(10.0、20.0和40.0μM)对SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导TAM M2极化表型和SKOV3细胞OCSLC特性作用以及p-STAT3和NF-κBp65蛋白表达水平的影响。结果1.金雀异黄素(10.0、20.0和40.0μM)以浓度依赖方式降低SKOV3源性OCSLC共培养THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达水平和IL-10浓度水平(P0.05);同时,促进THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成(P0.05)。2.金雀异黄素(10.0、20.0和40.0μM)抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达,呈浓度依赖性(P0.05)。3.金雀异黄素(10.0、20.0和40.0μM)抑制SKOV3源性OCSLC共培养THP-1巨噬细胞STAT3蛋白磷酸化和NF-κBp65蛋白表达(P0.05)。小结金雀异黄素具有抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性获得作用。第四部分:金雀异黄素可能通过阻断IL-8/STAT3轴抑制TAM诱导卵巢癌干样细胞的特性目的阐释金雀异黄素通过阻断IL-8/STAT3信号轴抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性获得作用机制。方法金雀异黄素联合IL-8添加或IL-8免疫耗竭探讨其是否通过抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养IL-8分泌抑制THP-1巨噬细胞M2极化表型、p-STAT3和NF-κBp65蛋白表达及抑制SKOV3细胞OCSLC特性。利用腺病毒基因递送系统沉默或过表达THP-1巨噬细胞STAT3基因技术手段研究金雀异黄素通过抑制THP-1巨噬细胞STAT3活性抑制SKOV3源性OCSLC共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化表型和SKOV3细胞OCSLC特性作用。应用裸鼠SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞皮下共注射治疗实验模型,评价金雀异黄素灌胃给药联合表达STAT3 sh RNA腺病毒瘤内注射治疗SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共注射裸鼠移植瘤的体内有效性。结果1.添加10 ng/ml IL-8能有效拮抗金雀异黄素(10μM)抑制SKOV3源性OCSCLCs共培养诱导THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达和IL-10分泌(P0.05)和促进THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成作用(P0.05)。2.添加10 ng/ml IL-8能有效拮抗金雀异黄素(10μM)抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达作用(P0.05)。3.添加10 ng/ml IL-8能有效拮抗金雀异黄素(10μM)抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养的THP-1巨噬细胞STAT3蛋白磷酸化和NF-κBp65蛋白表达(P0.05)。4.IL-8免疫耗竭协作金雀异黄素(10.0μM)抑制SKOV3源性OCSCLCs共培养诱导THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达和IL-10分泌(P0.05)和促进THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成作用(P0.05)。5.IL-8免疫耗竭协作金雀异黄素(10.0μM)抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达作用(P0.05)。6.IL-8免疫耗竭协作金雀异黄素(10.0μM)抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养的THP-1巨噬细胞STAT3蛋白磷酸化和NF-κBp65蛋白表达(P0.05)。7.STAT3 sh RNA协作金雀异黄素(10.0μM)抑制SKOV3源性OCSCLCs共培养诱导THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达和IL-10分泌(P0.05)和促进THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成作用(P0.05)。8.STAT3 sh RNA协作金雀异黄素(10.0μM)抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达作用(P0.05)。9.STAT3 sh RNA协作金雀异黄素(10.0μM)抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养的THP-1巨噬细胞STAT3蛋白磷酸化和NF-κBp65蛋白表达(P0.05)。10.STAT3基因转导拮抗金雀异黄素(10.0μM)抑制SKOV3源性OCSCLC共培养诱导THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达和IL-10分泌(P0.05)和促进THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成作用(P0.05)。11.STAT3基因转导拮抗金雀异黄素(10.0μM)抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达作用(P0.05)。12.STAT3基因转导拮抗金雀异黄素(10.0μM)抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养的THP-1巨噬细胞STAT3蛋白磷酸化和NF-κBp65蛋白表达(P0.05)。13.STAT3基因转导对抗金雀异黄素(10.0μM)联合STAT3 sh RNA抑制SKOV3源性OCSCLC共培养诱导THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达和IL-10分泌(P0.05)和促进THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成作用(P0.05)。14.STAT3基因转导对抗金雀异黄素(10.0μM)联合STAT3 sh RNA抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达作用(P0.05)。15.STAT3基因转导对抗金雀异黄素(10.0μM)联合STAT3 sh RNA抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养的THP-1巨噬细胞STAT3蛋白磷酸化和NF-κBp65蛋白表达(P0.05)。16.金雀异黄素和STAT3 sh RNA协作抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共注射裸鼠移植瘤生长(P0.05)。小结金雀异黄素通过阻断IL-8/STAT3信号轴抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性获得。结论1.IL-8/STAT3信号轴活化促成SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性。2.金雀异黄素具有抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性作用。3.金雀异黄素通过阻断SKOV3源性OCSLC共培养THP-1巨噬细胞IL-8/STAT3信号轴抑制THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R737.31

中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026