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《暨南大学》 2017年
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ARDS中LBP对fractalkine表达的影响及信号转导机制

黄霞  
【摘要】:研究背景:急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是临床上常见的危重症,病死率高,内毒素血症介导的炎性反应是ARDS发病的常见原因之一。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是内毒素的主要成份。脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)是存在于正常人和动物血清中的一种糖蛋白,在炎症反应的急性期升高,参与多种炎症因子的调控。LPS与LBP结合形成的LPS-LBP复合物激活单核细胞、巨噬细胞和其它细胞上的CD14/TLR4受体,Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)激活后可介导LPS胞内信号转导,转导通路向两个方向进行,即丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)通路和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路。MAPK、NF-κB信号通路活化后通过调节下游炎症因子的表达诱发炎症反应。Fractalkine(FKN)是趋化因子CX3C家族的唯一成员,一方面FKN于炎性细胞在血管壁上的募集和内皮细胞的损伤具有重要的作用,而另一方其通过对细胞凋亡的抑制作用起到抗炎作用。目前LBP对LPS激活MAPK、NF-κB是否存在调节作用及其对FKN表达的影响尚不清楚。目的:通过研究LBP、FKN在ARDS患者外周血、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的表达变化,明确其与ARDS患者血清内毒水平、病情严重度、预后的关系,并进一步研究LBP对LPS刺激的A549细胞以及LPS诱导的ARDS大鼠动物模型中FKN的表达的影响及其细胞信号转导机制,试图阐明LBP、FKN在ARDS发病中的作用,明确参与LBP调控FKN的细胞信号转导通路,寻找出ARDS治疗的新靶点。方法:第一部分:RT-PCR检测健康对照组和ARDS患者外周血LBP、FKN m RNA,ELISA检测肺泡灌洗液、外周血LBP、FKN蛋白的表达,并研究上述指标与ARDS患者血浆内毒素水平、病情严重程度及预后的关系。第二部分:分别在使用LBP质粒DNA、LBP sh RNA质粒DNA、p38MAPK、p65NF-κB信号通路的抑制剂SB203580、SC-514进行预处理的A549细胞上,使用LPS刺激后,RT-PCR检测细胞的LBP、FKN m RNA的表达,ELISA检测细胞培养上清液中LBP、FKN蛋白,western blotting检测细胞的LBP、FKN、磷酸化p38MAPK(phospho-p38MAPK)、磷酸化p65蛋白(phospho-p65)蛋白的表达,免疫荧光染色和共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)观察phospho-p38MAPK、phospho-p65的细胞核转移的情况。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,COIP)检测LBP与phospho-p38MAPK、phospho-p65的相互作用。第三部分:在大鼠模型上,分别经尾静脉注射LBP抑制多肽LBPK95A,p38MAPK、p65NF-κB信号通路的抑制剂SB203580、SC-514对大鼠进行预处理后,再注射LPS,RT-PCR检测大鼠肺组织的LBP、FKN m RNA表达,ELISA检测大鼠肺组织匀浆和大鼠血清LBP、FKN蛋白的表达,western blotting检测大鼠肺组织匀浆中LBP、FKN、phospho-p38MAPK、phospho-p65蛋白的表达,免疫组织化学方法检测FKN蛋白在大鼠肺组织中的表达分布及变化情况。结果:第一部分:与健康组相比,ARDS患者外周血LBP m RNA,血清LBP蛋白升高,FKN m RNA和蛋白表达下降(p均小于0.05)。与轻度组相比,中度组LBP m RNA、BALF及血清LBP蛋白表达的升高,重度组进一步升高;FKN表达下降,重度组进一步下降(p均小于0.05)。死亡组患者的LBP表达较存活组升高,FKN表达较存活组下降(p均小于0.05)。血清LBP蛋白水平与内毒素定量、APACHEⅡ评分、病情严重程度成正相关(p均小于0.05,r分别为0.8878,0.8365,0.862)。血清FKN蛋白水平与内毒素定量、APACHE II评分、病情严重程度成负相关(p均小于0.05,r分别为-0.7341,-0.7726,-0.695)。LBPm RNA与FKN m RNA,肺泡灌洗液、血清中的LBP蛋白与FKN蛋白成负相关(P均小于0.05,r分别为-0.8378,-0.7908,-0.8572)。LBP作为评估ARDS患者死亡的诊断指标,其敏感性与APACHEⅡ评分一致,但特异性优于APACHEⅡ评分。第二部分:与对照组相比,LPS刺激后,细胞LBP m RNA和蛋白升高,FKN m RNA和蛋白表达下降,LBP质粒DNA使FKN m RNA和蛋白表达进一步下降,LBP sh RNA质粒DNA、SB203580、SC-514均能抑制LPS介导的FKN m RNA和蛋白表达的下降;LPS使细胞的phospho-p38MAPK、phospho-p65蛋白的表达升高,LBP质粒DNA能促进这一作用,LBP sh RNA质粒DNA、SB203580和SC-514预处理能分别抑制细胞phospho-p38MAPK、phospho-p65蛋白的升高表达(p均小于0.05,n=6);免疫荧光染色及CLSM观察显示,使用LPS后A549细胞内phospho-p38MAPK、phospho-p65蛋白由细胞浆转移至细胞核,LBP质粒DNA促进phospho-p38MAPK、phospho-p65蛋白的核转移,使用LBP sh RNA质粒DNA、SB203580和SC-514预处理能分别抑制phospho-p38MAPK、phospho-p65蛋白的核转移。COIP检测到LBP与phospho-p38MAPK、phospho-p65存在相互作用。第三部分:与对照组相比,LPS使大鼠LBP m RNA和蛋白升高,FKN m RNA和蛋白表达下降,大鼠肺组织匀浆的phospho-p38MAPK、phospho-p65蛋白表达上升,LBPK95A能抑制ARDS大鼠肺组织匀浆和血清的LBP蛋白的升高,SB203580、SC-514的预处理能抑制ARDS大鼠肺组织匀浆和血清的FKN蛋白的下降,LBPK95A、SB203580和SC-514预处理能分别抑制ARDS大鼠肺组织匀浆phospho-p38MAPK、phospho-p65蛋白的升高表达(p均小于0.05,n=10);免疫组织化学染色观察到FKN蛋白主要分布于肺泡上皮细胞,LPS使大鼠肺泡上皮细胞FKN蛋白表达减少,LBPK95A、SB203580、SC-514的预处理能抑制LPS对FKN蛋白的下调作用。结论1.ARDS患者外周血LBP m RNA、肺泡灌洗液、血清的LBP蛋白水平升高,FKN m RNA和蛋白水平下降,LBP、FKN与ARDS患者的内毒素水平、病情严重程度相关,LBP可以作为一个评估ARDS患者死亡预后的新指标。2.在ARDS细胞和动物模型中,LBP可能通过激活p38MAPK、NF-κB信号通路,下调FKN的表达,参与了LPS介导了ARDS的过程。3.使用LBP抑制多肽LBPK95A进行干预,能减轻LPS引起的肺损伤,可能将成为ARDS治疗的一个新靶点。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R563.8

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