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《暨南大学》 2017年
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肺动脉高压中TGF-β1和PPAR-γ调控ET-1表达的分子机制研究

向淑麟  
【摘要】:研究背景:肺动脉高压(Pulmonary hypertension,PH)是指肺血管阻力持续增高超过一定界值的病理生理状态,可导致右心衰竭而危及生命。目前普遍认为PH的病理生理机制主要涉及血管收缩、细胞增殖、血管重塑、血栓形成和血管内皮损伤,多种因素的综合作用使肺血管压力进行性升高,最终导致右心功能衰竭和死亡,临床治疗效果不佳,发病机制不明。ET-1与肺血管重塑及肺动脉压力增高密切相关,然而具体的分子机制仍不清楚。已有研究表明ET-1、TGF-β1及PPAR-γ均参与了PH的病理发生及发展过程,PPAR-γ信号转导、MAPK及Smad信号通道激活以及ET-1高表达可能是肺动脉高压的病理生理基础,其具体机制及信号转导通路至今尚未完全明确,值得进一步研究。目的:通过检测ET-1、TGF-β1在PH患者血液中的表达水平、PPAR-γ在PH患者肺组织中的表达水平、TGF-β1对A549细胞表达ET-1的影响及其细胞信号转导机制、PPAR-γ对TGF-β1刺激A549细胞表达ET-1的影响及其细胞信号转导机制等研究,以阐明在A549细胞中TGF-β1及PPAR-γ对ET-1表达调控的分子机制。方法:第一部分:根据患者病史、临床症状及超声心动图结果选取47例PH患者,采用ELISA检测患者血清中ET-1及TGF-β1蛋白的表达水平;选取PH患者肺组织8例,通过免疫组织化学染色法研究PPAR-γ在PH患者肺组织的定位和表达及其临床意义。第二部分:根据临床研究的结果,在细胞水平上,研究TGF-β1、PPAR-γ对ET-1表达的影响,深入研究其分子调控机制。1.选择A549细胞,用TGF-β1刺激A549细胞后,通过q RT-PCR和ELISA检测ET-1的m RNA及蛋白表达水平,通过Western blot检测MAPK(磷酸化p38)、JNK/SAPK和NFκB(磷酸化p65,p50亚基)等信号通道的激活情况,结合使用p38激酶抑制剂SB203580等信号通道选择性抑制剂研究参与ET-1释放的主要信号转导途径。2.采用RNA干扰技术沉默PPAR-γ基因并转染A549细胞,另用PPAR-γ的抑制剂S2871作用于A549细胞,通过ELISA和q RT-PCR检测沉默了PPAR-γ基因及加入抑制剂S2871后的A549细胞ET-1蛋白和m RNA表达水平有何差异;构建含PPAR-γ基因的质粒并转染A549细胞,另用PPAR-γ的激动剂S2505作用于A549细胞,通过ELISA和q RT-PCR检测其在TGF-β1刺激作用下的ET-1分泌情况;采用Western blot检测研究PPAR-γ在TGF-β1刺激A549细胞释放ET-1这一过程中对其可能的细胞信号传导通路所起的作用。结果:第一部分:PH组患者血液中ET-1和TGF-β1蛋白表达水平较正常对照组明显增高,ET-1及TGF-β1蛋白的表达水平与肺动脉收缩压之间存在相关性,且增高的ET-1和TGF-β1之间也存在相关性;PPAR-γ在肺组织中主要表达于肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的胞核中,PH患者肺组织的PPAR-γ表达较正常对照组明显减少。第二部分:1.在体外培养的A549细胞中,q RT-PCR和ELISA结果提示TGF-β1可诱导ET-1的m RNA及蛋白表达增加,同时WB检测到phospho-p38 MAPK及phospho-Smad2表达增加,p38的特异性抑制剂SB203580可抑制TGF-β1诱导的ET-1 m RNA及蛋白表达,提示TGF-β1通过p38 MAPK及Smad2信号通路诱导ET-1的表达增加。2.PPAR-γ沉默或用PPAR-γ抑制剂S2871预处理A549细胞,q RT-PCR和ELISA结果显示TGF-β1诱导的ET-1 m RNA及蛋白表达均增加,WB同时检测到phospho-p38 MAPK及phospho-Smad2表达增加;PPAR-γ超表达或用PPAR-γ激动剂S2505预处理A549细胞,q RT-PCR和ELISA结果显示TGF-β1诱导的ET-1 m RNA及蛋白表达均下降,WB同时检测到phospho-p38 MAPK及phospho-Smad2表达降低,提示PPAR-γ可通过p38 MAPK及Smad2调控TGF-β1诱导的ET-1表达。结论:PH患者血液中的ET-1、TGF-β1表达增加,随着PH严重程度的加重,ET-1及TGF-β1蛋白的表达水平越高,且增高的ET-1和TGF-β1之间存在相关性;PH患者肺组织中的PPAR-γ表达减少;在体外培养的A549细胞中,TGF-β1通过p38 MAPK及Smad2信号通路诱导ET-1分泌增加且这一过程受PPAR-γ调控。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R544.1

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