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LncRNA-PVT1下调抑制伯基特淋巴瘤细胞增殖的分子机制

肖雨  
【摘要】:目的本研究旨在探讨长链非编码RNA(long-non coding RNA,lncRNA)PVT1下调对伯基特淋巴瘤(Burkitt`s lymphoma,BL)细胞(Raji和Namalwa)增殖抑制作用的分子机制,为开发以PVT1为靶点的肿瘤治疗提供科学的研究证据。方法借助生物信息学工具找寻BL组织中异常表达的lncRNA-PVT1与miRNA,借助Starbase与Jefferson数据库分析PVT1与miRNA位点的结合,筛选出下一步研究所关注的miRNA(miR-29b);运用CCLE数据库中1457个肿瘤细胞株的seq-RNA数据分析不同组织来源的细胞株PVT1和miR-29b的表达差异,同时分析两分子间的相关性。通过RNA干扰技术下调Raji细胞内PVT1后检测胞内miR-29b表达量的改变;采用双标荧光素酶报告实验证实两者间可在结合位点结合。运用RNA干扰、RNA小分子模拟物等技术研究PVT1和miR-29b对BL细胞增殖能力的影响;CCK8法用于检测细胞的增殖能力、流式分析细胞周期与凋亡的变化。qRT-PCR和Western-Blot用于检测改变PVT1和miR-29b表达量后Raji细胞周期相关蛋白CDK(CDK4)和CKI(CDKN1A/CDKN1B/CDKN2A)的基因及其蛋白的改变。通过Western-Blot检测Raji细胞在PVT1及miR-29b变化前后AKT/FOXO1信号通路的活化情况,同时使用FOXO1抑制剂(AS1842856)处理BL细胞观察细胞增殖能力及细胞周期的改变,并检测周期相关蛋白的表达情况。结果数据库的分析结果显示,与正常淋巴组织组相比,BL组中PVT1和miR-29b的表达量均有明显改变,具体为BL组中PVT1的表达量上调1.7倍(p0.001),相反地,miR-29b则下调大于4倍(p=0.003)。对CCLE数据库所收集的44种不同组织来源肿瘤细胞株中PVT1与miR-29b表达量的相关性分析结果显示两者间有显著负相关(r~2=-0.359,p=0.031),但MYC与miR-29b的表达量之间并没有发现明显相关关系(r~2=-0.243,p=0.167)。采用Starbase和Jefferson数据库对PVT1和miR-29b结合位点分析的结果显示,PVT1 RNA的3`非翻译区(UTR)存在miR-29b的结合位点(chr8:128952169-128952190[+]);此外,在Raji细胞内下调PVT1的实验发现,伴随Raji细胞内PVT1表达量降低可诱导miR-29b表达量上升(p0.05);双标荧光素报告基因实验进一步证实miR-29b可结合到PVT1的3`-UTR(p0.05)。下调PVT1亦或升高miR-29b均显著抑制Raji和Namalwa细胞的增殖(p0.05),而且增殖抑制效应被联合使用miR-29b抑制物削弱(p0.05);在Raji和Namalwa细胞PVT1的下调和miR-29b的上调诱导了细胞周期G0/G1阻滞(p0.05),该效应同样可被miR-29b抑制物的处理部分抵消。周期相关基因的mRNA与蛋白水平的检测结果显示,下调PVT1或是上调miR-29b均导致CDKN1A/CDKN1B/CDKN2A表达量增加和CDK4表达量降低;同时,伴随着PVT1和miR-29b表达量的改变Raji细胞内AKT/FOXO1信号通路的活性也发生变化。AKT/FOXO1信号通路下游的FOXO1功能的研究表明,抑制FOXO1活性降低了BL细胞增殖能力和阻碍了细胞周期的进程,以G0/G1期改变为主,这与p-FOXO1(Ser319)含量的下降有关,同时,FOXO1的抑制导致了细胞周期相关蛋白CKI和CDK表达水平的改变。结论1、生物信息学分析发现BL中存在lncRNA-PVT1的高表达和miR-29b的低表达,并且肿瘤细胞中PVT1与miR-29b的表达呈负相关;2、PVT1的下调和miR-29b上调抑制BL细胞(Raji和Namalwa)的增殖;3、PVT1可通过结合miR-29b而影响BL细胞(Raji和Namalwa)的增殖,且Raji细胞内该效应与AKT/FOXO1信号通路功能状态改变引起的FOXO1磷酸化异常有关,p-FOXO1减少可促进BL细胞内周期相关蛋白CDK家族中CDK4和CKI家族中CDKN1A/CDKN1B/CDKN2A表达改变,从而影响了细胞周期的进程。


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