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ADH3对白念珠菌毒力及抵抗巨噬细胞杀伤的影响

李嘉萍  
【摘要】:目的:ADH3编码乙醇脱氢酶III(alcohol dehydrogenase III,Adh3p),主要参与乙醇降解反应,但其对病原微生物致病力的影响尚未有报道。本课题通过敲除白念珠菌ADH3,旨在探究其对白念珠菌毒力及抵抗巨噬细胞杀伤的影响,明确ADH3与白念珠菌致病相关作用及机制。方法:第一部分:以白念珠菌标准株SC5314为亲本株,采用SAT1-Flipper基因敲除策略构建ADH3双等位基因敲除株,并通过PCR以及测序技术验证ADH3敲除成功。第二部分:(1)通过体外生长动力学实验测定亲本株和ADH3敲除株在0-96 h OD_(600)值,并描绘生长曲线,以判断ADH3缺失后对白念珠菌的生长影响。(2)通过固体和液体菌丝形成实验分别测定亲本株和ADH3敲除株在不同菌丝诱导培养基中菌丝形成的差异,判断ADH3缺失后对于白念珠菌菌丝形成的影响。(3)采用微生物吸附碳氢化合物方法测定亲本株和ADH3敲除株对碳氢化合物吸附的差异,判断ADH3缺失后对白念珠菌细胞表面疏水性的影响。(4)通过XTT法检测亲本株和ADH3敲除株生物膜活性差异,观察ADH3缺失后对白念珠菌生物膜形成的影响。(5)通过黏附实验测定亲本株和ADH3敲除株对12孔板黏附的差异,判断ADH3缺失后对白念珠菌黏附的影响。第三部分:(1)通过巨噬细胞杀伤实验测定体外菌体与巨噬细胞共同培养后菌体存活率,探究ADH3缺失后白念珠菌对巨噬细胞杀伤作用的抵抗能力的影响。(2)通过DCFH-CA探针监测亲本株与ADH3敲除株细胞内活性氧(ROS)水平,探究ADH3缺失后对白念珠菌ROS含量的影响。(3)采用NAD~+/NADH-Glo?Assay试剂盒测定亲本株与ADH3敲除株NAD~+/NADH比值,探究ADH3缺失后对白念珠菌还原当量的影响。结果:第一部分:PCR结果显示亲本株条带大小为1224 bp,ADH3敲除株条带大小为555 bp,且只有单一目标条带,说明ADH3双等位基因已经被敲除。PCR产物测序结果进一步显示亲本株含有ADH3完整序列,而敲除株不含ADH3序列,说明成功构建ADH3敲除株。第二部分:(1)体外生长动力学结果显示ADH3敲除株与亲本株生长曲线无差异;敲除株和亲本株倍增时间分别为2.46 h和2.39 h,差异无统计学意义(P0.05),说明ADH3缺失后不影响白念珠菌生长和繁殖。(2)液体菌丝形成实验结果显示ADH3敲除株与亲本株均能形成正常的细长菌丝,菌丝形态、长度、出芽率无明显差异;固体菌丝形成实验结果显示ADH3敲除株与亲本株均能形成较大菌落,紧贴培养基表面,菌落表面有明显的褶皱,边缘大量菌丝密集交织并且生长浸润性菌丝,两者菌丝形态无明显差异,说明ADH3缺失后不影响白念珠菌菌丝形成能力。(3)细胞表面疏水性结果显示ADH3敲除株相对疏水性平均值为34.5%,亲本株相对疏水性平均值为47.6%,差异具有统计学意义(P0.05),说明ADH3缺失后降低白念珠菌细胞表面疏水性。(4)XTT结果显示ADH3敲除株吸光度平均值为1.81,亲本株吸光度平均值为1.84,差异无统计学意义(P0.05),说明ADH3缺失后不影响白念珠菌生物膜活性。(5)黏附实验结果显示ADH3敲除株与亲本株对12孔板黏附情况无明显差异,说明ADH3缺失后不影响白念珠菌黏附能力。第三部分:(1)巨噬细胞杀伤实验结果显示ADH3敲除株和亲本株的平均存活率分别是52.0%和66.6%,差异具有统计学意义(P0.05),说明ADH3缺失后不利于白念珠菌抵御巨噬细胞杀伤作用。(2)细胞内ROS含量测定结果显示ADH3敲除株体内ROS含量平均值是5689,亲本株是3564,敲除株是亲本株的1.6倍,差异具有统计学意义(P0.05),说明ADH3缺失后能增加白念珠菌细胞内ROS含量。(3)NAD~+/NADH比值测定结果显示ADH3敲除株和亲本株的NAD~+/NADH比值平均值分别是20.2和15.1,敲除株是亲本株的1.3倍,差异具有统计学意义(P0.05),说明ADH3缺失后降低白念珠菌还原当量。结论:本课题通过SAT1-Flipper基因敲除策略成功构建白念珠菌ADH3双等位基因敲除株。敲除ADH3不影响白念珠菌生长以及菌丝形态转换、生物膜、黏附等毒力因素,但降低了细胞表面疏水性。ADH3缺失降低白念珠菌对巨噬细胞杀伤作用的抵抗能力,其极可能是细胞内ROS的增加及细胞表面疏水性的降低所引起。为了解ADH3参与白念珠菌对宿主致病作用及其机制提供依据。


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