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两种微型绿藻营养生理及原生质体制备与杂交育种的研究

陈波  
【摘要】: 雨生血球藻(Heamatococcus pluvialis)与普通小球藻(Chlorella vulgaris) 均为单细胞、光能自养的淡水绿藻。由于其具有较高的营养价值及高光能效应, 近年来越来越受到人们的重视。从应用研究逐渐转向商业生产,同时藻种也需 要进行必要的改进。以细胞融合为杂交育种手段,不失为一种简便、直接、快 速的单细胞微藻育种方法。 雨生血球藻与普通小球藻在营养生理上有着较大的差异。雨生血球藻不能 够利用以尿素为氮源或者以醋酸盐为碳源的培养基;普通小球藻则可以充分地 利用上述两种营养成分,并且在高盐浓度的培养基中迅速地生长。 本文采用酶法制备雨生血球藻和普通小球藻的原生质体。根据细胞壁的差 异,分别采用不同的酶及处理方法。雨生血球藻的原生质体制备选用了0.06% 蛋白酶K,pH7.8,35℃处理1小时,最高可得到48.70%的原生质体形成率, 以及在以聚乙二醇(PEG6000)为渗透压调节剂的再生平板上,原生质体再生 率最高可达到60.32%。针对小球藻细胞壁结构的特殊性和多样性,进行了一 系列的酶解条件实验。最后确定的理想酶解条件为:在2DG(2-脱氧-d-葡萄 糖)预培养24小时后,用2%纤维素酶,2%果胶酶,2%半纤维素酶,pH5.5, 30℃处理14小时。在上述的条件下,可以得到最高37.14%的原生质体形成率, 以及在以PEG6000为渗透压调节剂的再生平板上最高56.67%的原生质体再生 率。 原生质体的融合,结合了PEG法和高钙高pH法:混合两个亲本的原生质 体后,加入20%PEG6000,30℃处理30分钟,然后分两次加入高钙高pH的 融合洗涤液(处理时间分别为10分钟,20分钟)。融合处理后的细胞接种至 以PEG6000为渗透压调节剂的再生平板。 由于两个亲本细胞在形态上较大的差异,融合后对再生平板上长出的藻落 细胞进行显微镜观察,挑选出形态与普通小球藻类似,但个体较普通小球藻大 的融合子细胞。扩大培养后,通过对脂肪酸的定性定量分析,进一步验证了融 合子。


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