两种微型绿藻营养生理及原生质体制备与杂交育种的研究

【摘要】： 雨生血球藻（Heamatococcus pluvialis）与普通小球藻（Chlorella vulgaris） 均为单细胞、光能自养的淡水绿藻。由于其具有较高的营养价值及高光能效应， 近年来越来越受到人们的重视。从应用研究逐渐转向商业生产，同时藻种也需 要进行必要的改进。以细胞融合为杂交育种手段，不失为一种简便、直接、快 速的单细胞微藻育种方法。 雨生血球藻与普通小球藻在营养生理上有着较大的差异。雨生血球藻不能 够利用以尿素为氮源或者以醋酸盐为碳源的培养基；普通小球藻则可以充分地 利用上述两种营养成分，并且在高盐浓度的培养基中迅速地生长。 本文采用酶法制备雨生血球藻和普通小球藻的原生质体。根据细胞壁的差 异，分别采用不同的酶及处理方法。雨生血球藻的原生质体制备选用了0.06％ 蛋白酶K，pH7.8，35℃处理1小时，最高可得到48.70％的原生质体形成率， 以及在以聚乙二醇（PEG6000）为渗透压调节剂的再生平板上，原生质体再生 率最高可达到60.32％。针对小球藻细胞壁结构的特殊性和多样性，进行了一 系列的酶解条件实验。最后确定的理想酶解条件为：在2DG（2-脱氧-d-葡萄 糖）预培养24小时后，用2％纤维素酶，2％果胶酶，2％半纤维素酶，pH5.5， 30℃处理14小时。在上述的条件下，可以得到最高37.14％的原生质体形成率， 以及在以PEG6000为渗透压调节剂的再生平板上最高56.67％的原生质体再生 率。 原生质体的融合，结合了PEG法和高钙高pH法：混合两个亲本的原生质 体后，加入20％PEG6000，30℃处理30分钟，然后分两次加入高钙高pH的 融合洗涤液（处理时间分别为10分钟，20分钟）。融合处理后的细胞接种至 以PEG6000为渗透压调节剂的再生平板。 由于两个亲本细胞在形态上较大的差异，融合后对再生平板上长出的藻落 细胞进行显微镜观察，挑选出形态与普通小球藻类似，但个体较普通小球藻大 的融合子细胞。扩大培养后，通过对脂肪酸的定性定量分析，进一步验证了融 合子。