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《暨南大学》 2001年
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鲤鱼生长激素 cDNA在毕赤酵母中的胞内表达和分泌表达

李英华  
【摘要】: 生长激素(Growth hormone.GH)是脊椎动物下丘脑分泌的单链多肽激素,鱼类 生长激素参与鱼体的生长、发育和代谢等。鱼类脑垂体中天然生长激素含量极低,分 离纯化比较困难,基因工程技术为生产大量廉价的鱼生长激素创造了条件。实验证明, 重组鱼生长激素具有天然生长激素的功能,因此,生产基因重组鱼生长激素在水产养 殖领域具有重要的应用价值。本论文成功实现了鲤鱼生长激素(Cyprinus carpio GH, cGH)在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的胞内表达和分泌表达。 1 cGH在毕赤酵母细胞内的表达 根据cGH cDNA两端序列改造、设计一对引物。以cGH cDNA的克隆载体pUC18/GH 为模板,扩增cGH成熟肽cDNA,克隆入酵母整合型胞内表达载体pHIL-D2的EcoR I 位点,转化大肠杆菌,获得重组表达质粒pHIL-D2-GH(pD2-GH),酶切线性化,用电 脉冲法转化组氨酸缺陷型(HIS4~-)毕赤酵母菌GS115,用MD培养基筛选转化子,MM 培养基筛选转化子的表型,提取转化子基因组DNA,用PCR鉴定重组菌株。在MGY 培养基中培养,甲醇诱导,收集菌体,破碎细胞,取上清,SDS-PAGE分析,检测到 与标准cGH对应的特异蛋白带,重组cGH在细胞总蛋白中的含量约为2-3%。Western blotting显示,表达产物有免疫活性。将重组工程菌作为饲料添加剂投喂罗非鱼, 实验鱼的体重生长率明显高于对照组,证明重组cGH能促罗非鱼的生长。 2 cGH在毕赤酵母中的分泌表达 将cGH成熟肽cDNA克隆到分泌表达载体pPICZa A,构建重组表达质粒pPICZa A-GH,转化毕赤酵母GS115菌株,YPDZ培养基筛选重组子,经培养和诱导表达,取 培养基上清进行SDS-PAGE分析,结果表明,cGH分泌至培养基中。诱导3天时cGH 表达量最高,表达的cGH占培养基上清总蛋白的36.41%,表达量为300-400mg/L。不 同pH值实验表明,cGH表达的最适pH值为6.0。表达产物用阴离子交换层析分离纯 化,纯化的cGH注射罗非鱼,实验初步显示分泌表达的cGH具有促进罗非鱼生长作用。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:Q786

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【引证文献】
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1 陈莉;大黄鱼生长激素基因的分析及其在大肠杆菌中的表达[D];福州大学;2004年
2 廖杰;红鳍笛鲷GH、IGFⅠ基因的克隆和GH真核表达[D];广东海洋大学;2012年
【参考文献】
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【共引文献】
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2 严家彬;李新辉;吴淑勤;杜合军;;鳜鱼病毒核酸特异片段表达及高效价抗体制备[A];可持续水产养殖——资源、环境、质量——2003水产科技论坛论文集[C];2003年
3 张素芳;曹瑞兵;贾赟;周斌;陈溥言;;杂合抗菌肽cecA-mil的改造及在毕赤酵母中的分泌表达[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
4 高春生;范光丽;;淇河鲫生长激素全长cDNA的克隆与序列分析[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2008年
5 段修军;董飚;赵万里;王健;;6个白鹅品种GH基因第2外显子多态性研究[A];中国家禽科学研究进展——第十四次全国家禽科学学术讨论会论文集[C];2009年
6 高宇;雷连成;;人溶菌酶基因HLYZ在毕赤酵母中的表达及生物活性研究[A];中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会(第三届中国兽药大会学术论坛)论文集[C];2010年
7 郭玉平;郭显;周佳佳;桂丽娟;孙觅真;袁延超;邢会贤;伊海法;王丽媛;宋宪亮;孙学振;;不同棉种同义密码子偏爱性分析[A];山东省棉花学会第六次代表大会暨学术讨论会论文汇编[C];2013年
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1 张婕;嗜热真菌热稳定几丁质酶基因的克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年
2 张曈;海洋季也蒙毕赤酵母重组菊粉酶及其在产乙醇中的应用[D];中国海洋大学;2010年
3 米东;PTHrP和BMP-6在乳腺癌中的表达机制研究[D];南开大学;2010年
4 郭旭东;芦丁对奶牛泌乳性能、瘤胃消化代谢和对大鼠乳腺发育的影响[D];中国农业科学院;2011年
5 周怡;Fortilin和TAT融合蛋白在毕赤酵母的表达及对凡纳滨对虾免疫功能的影响[D];中国海洋大学;2011年
6 林听听;栉孔扇贝(Chlamys farreri)血细胞酶联免疫检测试剂盒的研制与应用[D];中国海洋大学;2011年
7 范武江;萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)及其杂交后代耐盐相关基因的研究[D];上海海洋大学;2011年
8 段慧明;毕赤酵母表达重组羟基化人源明胶的研究[D];北京化工大学;2011年
9 黄宗堂;重组人FLT-3配体胞外区在毕赤氏酵母中的表达与鉴定[D];天津医科大学;2002年
10 杜中军;苹果多酚HPLC测定方法及碱性磷酸酯酶在毕赤酵母中表达体系的建立[D];山东农业大学;2002年
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1 于宾宾;表达猪β-防御素-2成熟肽重组酵母工程菌的构建[D];华中农业大学;2010年
2 徐珏;毕赤酵母表达的ACE-C结构域高效发酵及纯化工艺的研究[D];浙江理工大学;2010年
3 王志强;内切葡聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母GS115中的表达[D];郑州大学;2010年
4 郭晓红;嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶的基因克隆、表达及性质研究[D];山东农业大学;2010年
5 仲伟磊;引入新的二硫键对植酸酶结构和功能的影响[D];山东农业大学;2010年
6 康雪燕;猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及免疫原性分析[D];山东农业大学;2010年
7 王希辉;鸡白介素18成熟蛋白突变体在毕赤酵母中的高效表达及其生物活性检测[D];山东农业大学;2010年
8 林雪;蛋白A的重组表达及重组菌的发酵过程优化[D];大连理工大学;2010年
9 哈志俊;绵羊GH基因多态性及其与生长性状相关性研究[D];甘肃农业大学;2010年
10 张浩;甘肃肉羊新品种群GH、GHR & Leptin遗传变异及其与体重的相关分析[D];甘肃农业大学;2010年
【同被引文献】
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1 傅萃长,朱作言;生长激素及其基因转移对鱼类生长和渗透压的调节作用[J];动物学报;2000年04期
2 冉雪琴,李文笙,林浩然;SRIF及CSH对斜带石斑鱼脑垂体生长激素合成和分泌的调控[J];动物学报;2004年02期
3 徐斌,张培军,苗宏志,李德尚,森山俊介,川内浩司;鲈鱼生长激素的分离及其生物活性鉴定[J];动物学报;1998年02期
4 简清,白俊杰,马进,李新辉,罗建仁;饲料中添加重组鱼生长激素对罗非鱼鱼种的促生长作用研究[J];淡水渔业;1999年03期
5 林浩然;神经内分泌因子调控鱼类生殖和生长的相互作用[J];动物学研究;2000年01期
6 肖东,陈松林,严安生,陈细华,邓文涛;鱼类消化道具有吸收外源生长激素的能力[J];动物学研究;2000年02期
7 王永兴;尉明皎;徐敬龙;金扩世;胡仲明;金宁一;;ECM830电穿孔仪在毕赤酵母电转化中的应用[J];动物医学进展;2006年S1期
8 王伟,汪亚平,孙永华,朱作言;酵母表达的重组草鱼生长激素对鲤鱼的促生长效应[J];高技术通讯;2000年12期
9 徐斌,张培军,李德尚;鱼类生长激素的分离、鉴定及其生理功能研究的进展[J];海洋与湖沼;1997年02期
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【二级参考文献】
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3 王黎,林浩然;不同年龄和性腺发育期鲤鱼不同脑区的sGnRH分布及其变化[J];动物学研究;1998年03期
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5 徐斌,李德尚,张培军;鱼类生长激素的分子生物学和应用研究的进展[J];海洋与湖沼;1997年05期
6 姚斌,张春义,王建华,范云六;高效表达具有生物学活性的植酸酶的毕赤酵母[J];中国科学C辑:生命科学;1998年03期
7 白俊杰,简清,马进,李新辉,罗建仁,张红军;鲑鱼生长激素cDNA在大肠杆菌中的表达及表达产物对罗非鱼促生长作用[J];农业生物技术学报;1998年04期
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9 陈松林;鱼类生长内分泌学和鱼类养殖[J];水产学报;1992年01期
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9 王留强;班巧英;贺琳;王玉成;;二色补血草LbDREB基因在酵母中的抗逆性分析[J];植物生理学报;2011年04期
10 孙国凤;;用酵母表达金枪鱼生长激素[J];生物技术通报;1990年11期
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1 陈定虎;王锡锋;李莉;周广和;;酵母表达美洲商陆抗病毒蛋白的活性检测[A];中国植物病理学会第七届代表大会暨学术研讨会论文摘要集[C];2002年
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7 张忠芳;高士争;李士泽;张玉静;;猪瘦蛋白基因在毕赤酵母中的表达[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年
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3 李瑶;HPV疫苗前景可期[N];医药经济报;2008年
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5 建明;医药上市公司谁领风骚[N];中国经营报;2000年
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5 张润祥;重组牛IFN-λ3的制备及其与IFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较研究[D];东北农业大学;2013年
6 张艳宇;人层粘连蛋白α4链LG1-3组件的研究[D];中国人民解放军军需大学;2003年
7 赵海艳;蛋白激酶C对PRRSV感染的影响以及GP5重组乳酸克鲁维酵母免疫效果的初步研究[D];中国农业大学;2014年
8 林萍;中间锦鸡儿油酸脱氢酶(FAD2)基因克隆及酵母表达调控的研究[D];中国林业科学研究院;2008年
9 黄圣兵;大鼠肝线粒体胆碱脱氢酶与电子传递黄素蛋白—泛醌氧化还原酶的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2003年
10 刘燕;哈茨木霉生物防治相关蛋白酶的基因克隆及功能研究[D];哈尔滨工业大学;2008年
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1 庄世文;食源酵母分离株风味物质及其三种酯代谢酶基因的分析[D];天津大学;2010年
2 章英;柑橘采后生防菌柠檬形克勒克酵母(34-9)遗传转化体系的建立[D];华中农业大学;2012年
3 张鲁滨;重组猪α干扰素的酵母表达及其对病毒的抑制作用[D];甘肃农业大学;2012年
4 刘伟;转坛紫菜hsp70酵母的生理生化研究[D];宁波大学;2012年
5 杨静;转萝卜过氧化物酶基因RsPrx1酵母表达条件优化及其抗性机理研究[D];河南师范大学;2011年
6 王德;补骨脂抗菌蛋白PscAFP的酵母表达及转基因烟草抗病性分析[D];西南大学;2010年
7 杨涵江;MSTN基因克隆、表达及其主动免疫研究[D];西北农林科技大学;2011年
8 冯伊琳;单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因的克隆及其在酵母中的表达[D];中国海洋大学;2011年
9 单喆;星星草PutCAX2在酵母中表达的功能解析[D];东北林业大学;2012年
10 江海燕;人可溶性CD14检测体系的建立及应用研究[D];第一军医大学;2004年
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