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《暨南大学》 2001年
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Bcl-2mRNA反义药物的设计和白血病细胞药物敏感性研究

雷小勇  
【摘要】: 目的:探讨RNA二级结构预测程序RNAstructure3.5模拟bc1-2mRNA二级 结构对bc1-2mRNA反义作用靶点选择的影响;观察不同靶点的反义寡核苷酸对 白血病细胞株HL60、K562细胞生长活性、bc1-2mRNA和蛋白水平、细胞凋亡 率和药物敏感性的影响;观察并比较不同结构骨架的反义物质—反义肽核酸与反 义寡核苷酸对HL60、K562生物学作用的异同;观察不同靶点的反义药物对临床 白血病人细胞生物学活性的影响。 方法:用RNA二级结构预测程序RNAstructure3.5预测bc1-2mRNA的二级 结构;用程序Blast对选定的序列进行人类基因组相似性评估证实序列在人类基 因组中具有唯一性;用Quickfold程序评估选定的反义序列出现自我杂交或形成 发夹的机率;Melting程序计算DNA/mRNA的理论熔点;用程序Lalign评估序列 相互之间形成二聚体的机率;细胞记数观察细胞的生存情况;MTT法测药物的半 数抑制率(IC50);用流式细胞仪、形态学观察及凝胶电泳观察细胞凋亡;免疫 荧光标记和半定量逆转录PCR观察细胞bc1-2蛋白水平和mRNA水平。 结果:在五个初选的反义序列中,靶向bc1-2mRNA蛋白编码区和翻译起始 区的反义寡核苷酸能有效地抑制HL60、K562细胞的生长活性,并且靶向蛋白编 码区的反义寡核苷酸1的作用比靶向翻译起始区2的强。与抑制细胞的生长活性 表现一致,两个不同靶点的反义寡核苷酸能明显地下调bc1-2蛋白的表达,并且 胞内的bc1-2mRNA水平也随之降低;在一定范围内,其作用是剂量和时间依赖 性的;靶向bc1-2mRNA蛋白编码区的反义寡核苷酸1降低细胞bc1-2蛋白和 学位论文:Bcl-ZmRNA反义药物的设计和白血病细胞药物敏感性研究 中文摘要 mRNA水平、促进细胞凋亡的作用较靶向翻译起始区的反义寡核昔酸2强。同时, 随机的无义寡核昔酸对白血病细胞的生长活性、bclZ蛋白水平及mRNA水平无 影响。 靶向 bclZ mRNA蛋白编码区和翻译起始区的反义寡核昔酸能提高 HL60、 K562细胞对VP16、Ara七、DNR和 AszO。的敏感性。HL60、K562细胞与反义寡 核昔酸和化疗药物共同培养48小时,琼脂糖凝胶电泳观察到明显的DNA梯带, 反义寡核昔酸1作用的处理组比反义寡核昔酸2作用的处理组小片段的DNA更 亮更宽。与反义寡核昔酸二比较,反义寡核昔酸1提高HL60细胞对Ara(、DNR 的敏感性及K562对Ara七的敏感性的作用要强些。从形态学上观察,可见细胞 凋亡时出现的一系列形态学变化。流式细胞仪检测发现反义寡核昔酸诱导细胞凋 亡的作用呈现剂量依赖性。 靶向bclZ mRNA蛋白编码区的反义肽核酸能有效地抑制HL60、K562细胞 的生长活性,降低hcf-2蛋白的水平和促进细胞凋亡,并且脂质体载体有助于反 义药物在细胞内发挥其反义作用。 在急性白血病和慢性淋巴细胞系白血病细胞中,bC12蛋白水平较高* 例AL 细胞B。12蛋白阳性率均数为43 ZI%,3例CLL细胞BC12蛋白阳性率均数为 68.33%卜两个不同靶点的反义药物能促进化疗药物诱导的细胞凋亡,降低bC12 蛋白水平;并且,反义寡核苦酸1处理组比反义寡核昔酸二处理组作用要强。 结论:*)分别在 bC12 mRNA翻译起始区和蛋白编码区发现了两个有效的反 义作用靶点,针对这两个靶点的反义寡核昔酸能特异性抑制HL60和K562细胞 的生长活性、降低 bclZ mRNA和蛋白水平、促进细胞的凋亡和改善细胞对 Vp、 Ara七、DNR和As。O。敏感性;o)靶向bclZ蛋白编码区的反义肽核酸有显著的 反义作用,并且其作用持续时间比相同条件下的反义寡核昔酸长:*)靶向bC12 mRNA翻译起始区和蛋白编码区的反义寡核昔酸能增强临床白血病人AL细胞对 Vp、Ara-c、DNR的敏感性和 CLL细胞对 Arp*及 DNR的敏感性;(4)在仇 12 mRNA翻译起始区外存在着有效的反义作用靶点
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