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重组人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中的高效表达及体外复性摸索

刘侃  
【摘要】:目的:胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factor-1,IGF-1)在细胞的生长、分化和凋亡中发挥重要作用,因此在临床应用中具有广阔的前景。本研究的目的在于优化重组大肠杆菌发酵及rhIGF-1表达条件,摸索体外复性的影响因子;从而建立工程菌高效表达IGF-1、简单快捷纯化及在体外复性的系统,为大规模生产IGF-1打下基础。 方法:本实验以融合一段截短型半乳糖苷酶及6个组氨酸标签(6xHis-tag)形式,在大肠杆菌BL21(+)中表达人IGF-1融合蛋白,经IPTG诱导后融合蛋白以包涵体形式存在;考察不同的接种量、诱导时间及是否添加葡萄糖等因素对蛋白表达量的影响,优化高效表达的发酵条件;利用镍离子(Ni~(2+))亲和层析分离融合蛋白包涵体;用羟胺切割纯化后的融合蛋白以除去标签,并摸索羟胺高效切割的优化条件;再经Ni~(2+)亲和层析纯化得到hIGF-1。纯化后的蛋白在不同复性系统中以稀释方法复性;利用高效液相色谱(HPLC)、MTT法细胞测活及荧光分光光度计等手段检验复性结果。 结果:发酵条件经优化后使培养的菌体量达42.4g/L,rhIGF-1融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的30%以上;羟胺切割效率可达65%以上,经一步Ni~(2+)亲和层析纯化可得到纯度在95%以上的hIGF-1;复性后天然rhIGF-1得率为135mg/L发酵液,HPLC检测显示复性后蛋白与标准蛋白保留时间一致;MTT法检测有明显的促3T3细胞增殖能力,比活性达0.868×10~6 U/mg。 结论:本研究设计的纯化和复性工艺简单易行,得到了较高纯度及生物学活性的胰岛素样生长因子-1,该工艺为实现rhIGF-1的大规模生产打下基础,对hIGF-1生物特性的研究和临床上的推广应用也具有重要的意义。


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