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《暨南大学》 2006年
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EGS抑制HCMV UL49基因表达及病毒复制的研究

张文军  
【摘要】:采用RT-PCR技术,在HCMV(AD169)感染的人胚肺成纤维细胞中检测到了HCMVUL49mRNA,因而首次在RNA水平证实HCMV UL49基因的表达。此外,进一步检测不同感染时间(1h、5h、9h、12h、24h、48h和72h)受染细胞中UL49mRNA的表达情况,初步判断UL49并非即刻早期表达基因(IE),而可能是一个早期(β2)表达基因。 根据HCMV UL49mRNA的序列,借助计算机软件模拟,设计了一组针对HCMV UL49mRNA不同靶位的EGS(共8个,分别命名为EGS1~EGS8),以此作为筛选库。通过胞外初筛、胞内复筛和胞内抗病毒活性的检测,拟从中筛选出具有抗病毒活性的EGS。1)胞外初筛:首先从HeLa细胞中提取具体外切割活性的RNase P,并以此建立了一种EGS胞外筛选系统。通过该系统证实,所设计的八个EGS中,有六个EGS具有靶向引导切割活性,它们分别是EGS1、EGS3、EGS4、EGS5、EGS6和EGS7,其余的EGS2和EGS8则无明显活性。在具活性的六个EGS中,各EGS的靶向引导切割效率有所不同。其中EGS1、EGS3、EG6和EGS7四个EGS的活性较强,靶向引导切割的效率均超过50%;而EGS4和EGS5的靶向引导切割效率则均低于50%。2)胞内复筛中:首先将UL49基因克隆至pGEFP-N1质粒绿色荧光蛋白基因的上游,以构建UL49-绿色荧光蛋白融合表达载体(pUL49/EGFP-N1)。将EGS与该融合蛋白表达载体以脂质体共转染HeLa细胞(同时以红色荧光质粒pDsRed2-C1,作为转染的内对照),建立了一种有效的EGS胞内复筛系统。通过荧光显微观察、Typhoon扫描及流式细胞仪检测,证实胞外初筛中活性较强的四个EGS中,只有EGS1、EGS3和EGS6具有明显的胞内靶向抑制活性,而EGS7的活性则较弱。3)胞内抗病毒活性的检测:将初筛及复筛证实有效的EGS分别以脂质体转染HELF细胞,然后再以AD169病毒株感染。在感染24h、48h和72h后,抽提感染细胞的总RNA,以相对荧光定量PCR(β-actin作内参)检测其中HCMVUL49mRNA的含量。结果表明:EGS1、EGS3、EGS6和EGS7对HCMV UL49mRNA表达的抑制率分别为74.87±2.85%、17.85±4.16%、89.77±0.91%和35.40±1.92%。其中,EGS1和EGS6的靶向抑制活性明显高于其余两个EGS(P<0.01)。进一步以EGS1和EGS6作为研究对象,通过绝对荧光定量PCR的方法检测EGS转染后病毒培养液中HCMV基因组DNA的变化,以此评价EGS1及EGS6对胞内HCMV复制的抑制活性。结果显示,E6S1和EGS6转染后,病毒的增殖曲线均明显低于未转染EGS的对照组。从而证实了EGS1和EGS6在胞内的抗病毒效应。其中,EGS6的抑制作用较强(抑制率为89.62±2.55%~95.9±1.98%),EGS1的抑制作用则相对较弱(抑制率为40.25±1.05%~70.85±2.03%)。 总之,通过本研究一系列的筛选步骤,获得两种具有胞内抗HCMV活性的EGS序列(EGS1和EGS6),从而为新型抗HCMV反义药物的进一步研究与开发奠定了基础。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R346

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