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rADTZ在大肠杆菌中的可溶性融合表达、纯化及其圆二色性分析

胡熔  
【摘要】: 黄曲霉毒素是一类强致癌诱变剂,其毒性大,稳定性高,对人类和动物的危害较大,其中黄曲霉毒素B_1是毒性最强的一种。该毒素的转化、去毒一直是受到关注的问题。本研究所长期从事黄曲霉毒素生物去毒转化的研究,筛选到一株产黄曲霉毒素解毒酶的菌株E-20。目前已运用基因工程技术获得了该黄曲霉毒素解毒酶基因的全长cDNA序列,并实现了其在甲醇诱导的毕赤酵母系统中的分泌表达。 由于ADTZ在毕赤酵母中表达发酵时间周期长、需要精确控制发酵和表达量的提高难度大等问题,为了更简便的获得纯酶用于进一步的研究与应用,本工作将黄曲霉毒素解毒酶基因的ORF克隆到含有融合标签MBP的pMAL—C2X载体上,构建原核重组表达质粒pMAL—C2X—ADTZ,将其导入大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导实现了MBP_ADTZ融合蛋白的高效表达,表达产物经Western blot检测在118KD分子量处有一明显的特异杂交带。在诱导温度为37℃时,MBP_ADTZ融合蛋白为包涵体表达,当降低诱导温度至20℃时,MBP_ADTZ融合蛋白绝大部分为可溶性表达,通过IPTG浓度、IPTG加入时机和诱导时间的优化后,其融合蛋白的表达量可达到0.64g/L,按分子量比例推算出rADTZD蛋白的理论表达量为0.45g/L。细胞裂解物经Amylose亲和层析后得到电泳纯的单一融合表达产物。该融合蛋白经Factor Xa酶切裂解后,得到分子量分别约为42KD的MBP蛋白和76KD的rADTZ蛋白。酶切裂解产物经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析后得到单一纯度的rADTZ蛋白,其获得量为0.397g/L。对rADTZ蛋白进行生物学活性测定,结果表明rADTZ蛋白具有降解AFB_1的酶活性,其去毒率达到了19.66%,酶比活为26.25U/g。圆二色光谱对rADTZ蛋白二级结构的分析结果为:a—螺旋为43.3%、β-折叠为31.1%、B—转角为10.5%和无规则卷曲为15.1%。 本研究成功构建了原核重组质粒pMAL—C2X—ADTZ,实现了rADTZ在Rosetta(DE3)中的高效表达。细胞裂解物经Amylose亲和层析、Factor Xa酶切和Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析后得到电泳纯的rADTZ蛋白。原核表达的rADTZ蛋白具有降解AFB_1的酶活性。圆二色性分析结果表明:rADTZ含a—螺旋和β-折叠的理论推导值与实验值相符。本工作为探讨原核表达黄曲霉毒素解毒酶的可行性做了重要的基础工作。


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