收藏本站
《暨南大学》 2009年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

抗肝癌噬菌体单链抗体二聚体的制备与初步应用研究

别彩群  
【摘要】: 研究背景和意义:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第五常见的癌症,是我国癌症中的第二号杀手,全球50%以上的肝癌发生在我国。目前传统的治疗如外科手术及放化疗等没有理想的疗效。单链抗体(Single chain variablefragment,scFv)分子量小、穿透力强、体内半衰期短、免疫原性低并且具有亲本抗体相同的抗原结合能力,可能成为肝癌靶向治疗的理想载体。我们课题组采用噬菌体抗体展示技术成功筛选出1株特异性抗肝癌噬菌体scFv 4-16(GenBank:DQ640759),并对其进行了体外亲和力成熟及人源化改造,获得了具有较高亲和力和较低免疫原性的scFv。初步研究显示特异性抗肝癌scFv 4-16对肝癌细胞及肝癌组织抗原具有较好的特异性,拥有较好的研究开发和临床应用潜力。但scFv是单价抗体,仍存在着亲和力较弱、稳定性较差、体内清除过快、在大肠杆菌中分泌表达量过小等不足。因此,本研究重点构建亲和力高和稳定性好的抗肝癌单链抗体二聚体,并实现其在毕赤酵母中的高效表达,制备单链抗体二聚体纳米颗粒,观察其对体外肝癌细胞增殖的影响。为探讨单链抗体对肝癌的放射免疫显像诊断和靶向治疗价值提供依据。 第一章抗肝癌噬菌体单链抗体二聚体的构建、表达与鉴定 目的:构建抗肝癌噬菌体单链抗体二聚体,并在大肠杆菌中可溶性表达,鉴定其生物活性。方法:将我室构建的抗肝癌噬菌体scFvDM连接肽的长度从15个氨基酸残基缩短至3-5个,克隆至载体pCANTAB5E,转化感受态大肠杆菌TG1并测序,对测序正确的阳性克隆予辅助噬菌体感染,制备噬菌体抗体,检测其相对亲和力,将亲和力指数最高的噬菌体抗体在大肠杆菌HB2151中进行诱导可溶性表达,采用SDS-PAGE、Western blotting鉴定表达产物,并进行浓度及特异性检测。 结果:测序结果显示成功构建三株抗肝癌噬菌体单链抗体二聚体(scFv-3、scFv-4、scFv-5),其亲和力指数是亲本抗体的3.5-6倍。将亲和力指数最高的一株二聚体(scFv-5,命名为BDM3)在大肠杆菌HB2151中可溶性表达,通过SDS-PAGE和Western blotting检测到目标蛋白带;ELISA结果显示:表达产物具有与肝癌细胞特异性结合活性,与胎肝细胞、胃癌细胞等均无交叉反应,但抗体表达的量较低,浓度仅为100μg/L菌液,不能满足后续的研究需要。结论:成功构建了抗肝癌噬菌体单链抗体二聚体基因,并获得可与肝癌细胞特异结合的高亲和力的抗肝癌单链抗体二聚体,为后续实现抗体在酵母中大量表达奠定基础。 第二章抗肝癌单链抗体二聚体在酵母中表达及其生物活性的鉴定 目的:实现抗肝癌单链抗体二聚体在毕赤酵母中高效表达,并鉴定所表达抗体的生物活性。方法:构建酵母表达载体pGAPZαA-BDM3,转化感受态大肠杆菌DH5α,选择测序正确的阳性克隆进行扩增后,电转化酵母细胞,表达抗体二聚体,对表达抗体进行纯化、二聚体分子量及形成比例、浓度检测,并鉴定其对肝癌细胞的结合活性和稳定性,免疫组化检测二聚体对肝癌组织抗原的特异性。结果:测序显示成功构建酵母表达载体pGAPZαA-BDM3,表达96小时抗体收获量最大,纯化后的抗体经凝胶过滤色谱检测,二聚体的分子量为62kD,二聚体形成比例为92%。二聚体表达量为30mg/L菌液,为大肠杆菌的300倍。抗肝癌单链抗体二聚体BDM3与三种肝癌细胞结合,而与正常肝细胞不结合,结合效价为1:128。稳定性实验证实抗肝癌单链抗体二聚体BDM3在37℃孵育16小时后与肝癌细胞的结合活性下降到50%,孵育48小时后完全失去结合活性,具有很好的稳定性。免疫组化显示二聚体与肝癌组织结合的阳性率比肝硬化、胃癌、肠癌、正常肝组织高,差异有统计学意义。结论:成功制备了高表达量、高特异性、较好的活性及稳定性的抗肝癌单链抗体二聚体BDM3,为制备免疫纳米颗粒及开展肝癌的放射免疫诊断和靶向治疗奠定了基础。 第三章免疫纳米颗粒制备、检测及其对肿瘤细胞增殖的影响 目的:制备高分子免疫纳米颗粒,并观察其对肝癌细胞增殖的影响。方法:采用离子交联的方法,以壳聚糖水溶性衍生物多糖为基材,将已获得的抗肝癌单链抗体二聚体制备成免疫纳米颗粒,检测纳米颗粒的表征、包封率及载药量,并通过MTT法观察免疫纳米颗粒对肝癌细胞株增殖的影响。结果:制备粒径为100-200nm的抗肝癌单链抗体二聚体高分子纳米颗粒,最佳包封率为53%,载药量为每毫克75微克抗体二聚体,高分子纳米颗粒对肿瘤细胞无毒性,但抗肝癌单链抗体二聚体高分子纳米颗粒显示较好的抗肿瘤作用,其对肝癌细胞的抑制率为34%左右,且有浓度依赖性。结论:成功制备了抗肝癌单链抗体二聚体高分子纳米颗粒,初步应用具有抑瘤性,为下一步开展体内肝癌的放射免疫诊断和靶向治疗奠定了基础。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R735.7

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 宋丽雅,于群,卜凤荣;几种主要的酵母表达系统研究进展[J];中国输血杂志;2003年03期
2 周则迅,袁汉英,何炜,高卜渝,李育阳;乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的组成型表达[J];复旦学报(自然科学版);2000年03期
3 刘晨光,刘成圣,孟祥红,陈西广,刘万顺;壳聚糖作为药物缓释材料的研究进展[J];高技术通讯;2003年03期
4 陈钟;戴新征;;壳聚糖及其纳米粒子在组织工程中的应用[J];国际生物医学工程杂志;2006年01期
5 李近;蒋国强;林莹;丁富新;;长效载药微粒研究进展[J];精细化工;2006年10期
6 杨晟,黄鹤,章如安,钱美琴,余有浩,钱雪明,袁中一;重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中分泌表达影响因素的研究[J];生物工程学报;2000年06期
7 黄岩山,董勇,李辉,王同映,裘霁宛,余应年;毕赤酵母表达重组人白细胞介素11的纯化与鉴定[J];生物工程学报;2001年03期
8 郭永志,沈孝宙;人胰岛素原在甲醇酵母(Pichia pastoris)中的高效表达[J];生物工程进展;1999年06期
9 胡世界;罗素兰;张吉贞;长孙东亭;;巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略[J];生物技术;2007年06期
10 张平武,李育阳;新型酵母表达系统的研究[J];生物技术通讯;1999年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 于小丽;徐维平;马旖旎;王艳萍;张莉;;纳米技术在肿瘤治疗中的应用[J];安徽医药;2011年05期
2 陈立新,李文杰,何晓华,黄继烈,曾智凡,黄劭敏;头颈肿瘤立体定向分次照射靶区定位的误差分析[J];癌症;2004年02期
3 孙柏欣;刘长远;陈彦;赵华;赵彤华;李柏宏;;基因表达系统研究进展[J];现代农业科技;2008年02期
4 陈庆梅;宗小林;;磁性纳米材料及其在癌症诊疗中的应用[J];微纳电子技术;2009年06期
5 冷雪;陈劲春;董鹏;;重组人胰岛素及C肽的分离纯化[J];北京化工大学学报(自然科学版);2006年05期
6 吕庆文,李树祥,李光明;X刀治疗计划设计的研究[J];北京生物医学工程;2001年01期
7 董清华;沈元月;;酵母表达系统研究进展与展望[J];北京农学院学报;2008年02期
8 孙井辉;王红英;钱斯日古楞;庞文静;;纳米级磁性壳聚糖微球的靶向性研究[J];材料导报;2011年S1期
9 吴瑞红;;以乳液聚合法制备单分散聚合物微球[J];产业与科技论坛;2011年23期
10 王艳;;浅析巴斯德毕赤酵母表达系统的研究[J];山东畜牧兽医;2010年10期
中国重要会议论文全文数据库 前5条
1 关鲁雄;丁萍;欧阳冬生;;改性壳聚糖药物缓释剂的合成与性能表征[A];中国化学会2005年中西部十五省(区)、市无机化学化工学术交流会论文集[C];2005年
2 符华林;张莉;杨珊;;盐酸多西环素微囊的制备及体外释放度研究[A];兽医药品学——2010第三届中国兽药大会论文集[C];2010年
3 郑瑀;侯世祥;;壳聚糖及其衍生物作为抗肿瘤药物载体的研究进展[A];中华中医药学会第九届制剂学术研讨会论文汇编[C];2008年
4 高艳辉;邱智东;;天然可生物降解高分子辅料在缓控释制剂中的应用[A];中华中医药学会第九届制剂学术研讨会论文汇编[C];2008年
5 马琳;马继平;要志丹;;磁性分子印迹固相萃取吸附剂的制备及应用[A];第七届全国仪器分析及样品预处理学术研讨会论文集[C];2013年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张曈;海洋季也蒙毕赤酵母重组菊粉酶及其在产乙醇中的应用[D];中国海洋大学;2010年
2 李荣春;新型季铵化壳聚糖衍生物的制备及其抑菌和抗氧化活性研究[D];新疆农业大学;2010年
3 叶刚;采用抗体库优化法对抗肝癌单链抗体人源化改造的研究[D];暨南大学;2007年
4 蔡维嘉;利用毕赤酵母系统的丙型肝炎病毒重组E1E2糖蛋白的表达、纯化和性质研究[D];武汉大学;2010年
5 张志奋;浆膜动态性能研究及其在蒙脱土掺杂浆料改性效果评价中的应用[D];东华大学;2010年
6 张丽青;嗜热毛壳菌超氧化物歧化酶基因的克隆、表达及转基因烟草耐盐性研究[D];山东农业大学;2011年
7 张秀丽;靶向白血病干细胞的抗CD3/IL3及其二硫键稳定构型的融合蛋白的构建、表达及活性研究[D];北京协和医学院;2011年
8 迟春萍;人铜锌超氧化物歧化酶在毕赤酵母中高表达及其中试工艺研究[D];吉林农业大学;2011年
9 刘菲;天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究[D];四川农业大学;2011年
10 艾晓辉;多西环素在斑点叉尾鮰中安全使用及快速检测技术研究[D];四川农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 徐珏;毕赤酵母表达的ACE-C结构域高效发酵及纯化工艺的研究[D];浙江理工大学;2010年
2 王志强;内切葡聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母GS115中的表达[D];郑州大学;2010年
3 仲伟磊;引入新的二硫键对植酸酶结构和功能的影响[D];山东农业大学;2010年
4 王强;鸡Gal-2成熟肽cDNA片段在毕赤酵母中的分泌表达与抑菌活性研究[D];安徽农业大学;2010年
5 何浩礼;聚酰胺6及聚酰胺6/SiO_2纳米复合材料流变力学性能研究[D];湘潭大学;2010年
6 刘虎邱;丝胶改性水性聚氨酯的合成及其在天然乳胶中的应用[D];华东理工大学;2011年
7 张佳瑜;软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在毕赤酵母和枯草杆菌中的表达[D];江南大学;2010年
8 梁建鹤;阳极氧化法制备TiO_2纳米管阵列及其性质研究[D];福建师范大学;2010年
9 韩笑;黑曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆与表达研究[D];中南林业科技大学;2008年
10 张佳;KGM-PVA/CA三元共混胶粘剂制备工艺的研究[D];西北农林科技大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 宋丽雅,于群,卜凤荣;几种主要的酵母表达系统研究进展[J];中国输血杂志;2003年03期
2 徐梁,张学庸,莫简,樊代明,陈希陶,孙淑芬,郭正仁,王多宁;胃癌免疫脂质体导向阿霉素的实验研究[J];第四军医大学学报;1991年01期
3 任非,陈建海,陈志良,许军;MMC-聚氰基丙烯酸正丁酯磁性纳米球对BEL-7402人肝癌细胞裸小鼠移植瘤的作用[J];第四军医大学学报;2005年16期
4 杨冬华,毕向军,农玉新;抗肝癌单链抗体基因库的制备[J];第一军医大学学报;2001年12期
5 刘 婷,袁汉英,沈其梅,李育阳,汪垣;在杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的表达及调控[J];复旦学报(自然科学版);1998年04期
6 周则迅,袁汉英,何炜,高卜渝,李育阳;乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的组成型表达[J];复旦学报(自然科学版);2000年03期
7 李文俊,王汉夫,卢玉华,汪志亮,钟伟;壳聚糖·聚丙烯酸配合物半互穿聚合物网络膜及其对pH和离子的刺激响应[J];高分子学报;1997年01期
8 袁汉英,潘辉,刘 婷,胡宝龙,李育阳,惠静毅,李光地,汪垣;乙肝病毒融合表面抗原SA-28基因在酵母中的表达[J];高技术通讯;1997年10期
9 李方,赵峰,尹玉姬,姚康德;壳聚糖基智能凝胶材料及其应用[J];化学通报;2001年03期
10 霍克克,虞兰兰,陈新杰,李育阳;酵母高稳定载体的构建及人-αA干扰素在酵母中的高表达和分泌[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1992年09期
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026