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《暨南大学》 2009年
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黄芪多糖、丹皮酚对高血压病血瘀证内皮细胞损伤模型TLR4、NF-κB表达的影响

张竞之  
【摘要】: 目的 通过TLR-NF-κB信号转导通路,探讨高血压病血瘀证的形成机理,黄芪多糖、丹皮酚治疗高血压病血瘀证的作用机制,验证高血压病血瘀证细胞模型。方法 1.对高血压病血瘀证的研究: (1).10%的高血压病血瘀证患者血清干预人脐静脉内皮细胞(HUVEC-C)24h,建立血瘀证细胞模型(血瘀证组),非血瘀证组、健康组、空白对照组分别用同等浓度的高血压病非血瘀证患者血清、健康人血清和不含血清培养基干预相同时间。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞的活性,倒置相差显微镜观察细胞形态。 (2).不同浓度的黄芪多糖、丹皮酚干预10%的高血压病血瘀证患者血清损伤HUVEC-C 24h,MTT法检测细胞的活性,倒置相差显微镜观察细胞形态。 (3).实时荧光定量(PCR)法测血瘀证组,非血瘀证组、健康组细胞果蝇样受体(TLR4)mRNA的表达。 (4).不同浓度的黄芪多糖、丹皮酚干预脂多糖(LPS)诱导HUVEC-C TLR4表达(24h)及核转录因子(NF-κB)活化(2h)。PCR法测TLR4 mRNA及NF-κBmRNA的表达,免疫印迹(Western-blot)技术测TLR4蛋白及NF-κB蛋白的表达。NF-κB的活化均用IκBα的降解反映。 2.对高血压病不同病情分级的研究: (1).高血压病1级组、2级组、3级组、健康组HUVEC-C分别用10%的高血压病1级患者血清、2级患者血清、3级患者血清、健康人血清干预24h,MTT法检测细胞的活性,倒置相差显微镜观察细胞形态。 (2).PCR法检测高血压病1级组、2级组、3级组、健康组细胞TLR4 mRNA的表达。 结果 1.血清作用24h后,细胞活性按健康组(0.3697±0.0548)、非血瘀证组(0.3196±0.0479)、血瘀证组(0.2120±0.0317)、空白组(0.1853±0.0129)的顺序降低,组间差异显著(P0.01或P0.001);血瘀证组细胞逐渐收缩变形,细胞间隙增大,胞浆内有暗色颗粒。 2.黄芪多糖、丹皮酚可减轻高血压病血瘀证患者血清对细胞形态变化的影响;细胞活性呈剂量依赖性增强,APS各组的OD值为:健康组(0.4419+±0.0216)、血瘀证组(0.2243±0.0298)、小剂量组(0.2340±0.0376)、中剂量组(0.2656±0.0233)、大剂量组(0.3487±0.0469),组间比较差异显著(P0.01或P0.001);Pae各组的OD值为:健康组(0.5290±0.0946)、血瘀证组(0.2888±0.0319)、小剂量组(0.3227±0.0371)、中剂量组(0.3732±0.0736)、大剂量组(0.4510±0.0909),组间差异显著(P0.01或P0.001)。 3.血清作用24h后,TLR4 mRNA的表达按健康组(5.4160×10~(-4)±0.2488×10~(-4))、非血瘀证组(6.4692×10~(-4)±0.0956×10~(-4))、血瘀证组(8.2598×10~(-4)±0.2685×10~(-4))的顺序逐渐增高,组间差异显著(P0.01)。 4.黄芪多糖、丹皮酚可呈剂量依赖性减少LPS诱导的TLR4 mRNA高表达,各组值分别为,健康组(5.4160×10~(-4)±0.2488×10~(-4))、血瘀证组(8.2598×10~(-4)±0.2685×10~(-4))、LPS诱导组(97.3569×10~(-4)±0.9599×10~(-4))、APS小剂量组(33.4288×10~(-4)±0.8112×10~(-4))、APS中剂量组(13.5707×10~(-4)±0.6434×10~(-4))、APS大剂量组(7.2484×10~(-4)±0.0566×10~(-4))、Pae小剂量组(10.7065×10~(-4)±0.6657×10~(-4))、Pae中剂量组(7.1994×10~(-4)±0.0939×10~(-4))、Pae大剂量组(6.4403×10~(-4)±0.1271×10~(-4));黄芪多糖、丹皮酚可呈剂量依赖性抑制LPS诱导的IκBαmRNA的降解,各组值分别为,健康组(0.4536±0.0164)、LPS诱导组(0.0665±0.0007)、APS小剂量组(0.0873±0.0007)、APS中剂量组(0.1333±0.0005)、APS大剂量组(0.1371±0.0004)、Pae小剂量组(0.0973±0.0003)、Pae中剂量组(O.1357±0.0016)、Pae大剂量组(0.1425±0.0012)。 5.黄芪多糖、丹皮酚可抑制LPS诱导的TLR4蛋白高表达和IκBα蛋白的降解。 6.血清作用24h后,细胞活性按健康组(0.4609±0.0382)、高血压病1级组(0.4241±0.0270)、2级组(0.3330±0.0249)、3级组(0.2116±0.0222)的顺序降低,健康组高于高血压病1级组,但差异不显著(P0.05),与其它各组差异显著(P0.01);2级组、3级组细胞逐渐收缩变形,细胞间隙增大,胞浆内有暗色颗粒。 7.血清作用24h后,TLR4 mRNA的表达按健康组(5.4160×10~(-4)±0.2488×10~(-4))、高血压病2级组(5.9333×10~(-4)±0.3431×10~(-4))、1级组(8.0697×10~(-4)±0.1249×10~(-4))、3级组(8.1314×10~(-4)±0.0702×10~(-4))的顺序逐渐增加,健康组低于1级组和3级组,差异显著(P0.01);健康组低于2级组,但差异不显著(P0.05)。 结论 1.血瘀证内皮细胞损伤模型符合中医发病因素,体现“病”“证”结合特点,又易于复制,有较高的可重复性。 2.APS、Pae可减轻高血压病患者血清对内皮细胞的损伤,增强细胞活性和维持细胞形态结构。 3.TLR-NF-κB信号途径介导的炎症反应和免疫紊乱可能是高血压病血瘀证形成的机制之一。 4.APS、Pae通过降低TLR4表达,抑制IκBα降解起抗炎调节免疫的作用,这可能是其活血化瘀作用的机理之一。 5.APS、Pae可通过降低TLR4的表达,抑制IκBα的降解,抗炎、调节免疫,起保护内皮细胞的作用。 6.TLR-NF-κB信号途径介导了高血压病的炎症反应和免疫紊乱,这可能是高血压病的发病机制之一。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R285

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