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《暨南大学》 2009年 博士论文
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扶正抗癌方、维生素C及两者联用防治肝癌作用的比较研究

彭磷基  
【摘要】: 目的: 原发性肝癌起病隐匿,恶性程度高,病情变化快,死亡率高,是我国最常见的恶性肿瘤之一,目前临床上缺乏有效的治疗方法。因此,寻找疗效明显、毒副反应少、延长带瘤生存时间和提高带瘤生活质量的肝癌治疗方法是目前临床肿瘤学的研究难点。 扶正抗癌方是笔者临床上用于治疗肝癌的中药验方;静脉注射维生素C(VC)是近年来在肿瘤基础研究和临床应用方面有潜在价值的研究热点之一。在前期临床研究结果及参考国外相关研究资料的基础上,本研究以Walker256移植性大鼠肝癌模型、二乙基亚硝胺(DEN)诱发性大鼠肝癌模型,及用体外培养的大鼠肝癌细胞(CBRH7919)和大鼠正常肝细胞(BRL)为研究载体,观察扶正抗癌方、VC及两者联用对大鼠肝癌发生、发展过程的干预作用,并进一步探讨其可能机制。 方法: 1.采用Walker256癌肉瘤细胞株接种SD大鼠制作原位移植肝癌模型,分为正常组、假手术组、模型组、中药低剂量组(扶正抗癌方水煎剂12.1g/kg灌胃)、中药中剂量组(扶正抗癌方水煎剂24.2g/kg灌胃)、中药高剂量组(扶正抗癌方水煎剂48.4g/kg灌胃)。定时记录体重、进食及饮水等一般状况;实验w1、w2、w3取材,检测血清总蛋白(STP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、白球比值(A/G)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及肿瘤诊断指示酶碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)和岩藻糖苷酶(AFU);称瘤重,测量瘤块长短径;取瘤组织行病理观察;记录肿瘤转移情况;观察各组大鼠的生存时间。研究不同剂量的扶正抗癌方对移植性大鼠肝癌的抑制作用,并探索最佳量效关系。 2.制备Walker256移植性肝癌模型,分为正常组、假手术组、模型组、VC低剂量组(维生素C钠2.83g/kg静脉注射)、VC高剂量组(维生素C钠5.65g/kg静脉注射)。定时记录各组大鼠的一般状况;检测肝功能(STP、ALB、GLB、A/G、ALT、AST、ALP、GGT、AFU);称瘤重、测量瘤块长短径;取瘤组织行病理观察。研究静脉注射不同剂量VC对移植性大鼠肝癌的抑制作用。 3.制备DEN诱发大鼠肝癌模型,分别给予扶正抗癌方48.4g/kg、维生素C钠2.83g/kg、扶正抗癌方48.4g/kg与维生素C钠2.83g/kg联用、化疗药优福定(UFT)0.09g/kg治疗。造模后w8、w14、w20取材,定时记录各组大鼠体重、进食饮水等一般状况;检测STP、ALB、GLB、A/G、ALT、AST、ALP、GGT、AFU,观察各组大鼠肝功能的变化;检测外周血中CD~(4+)/CD~(8+)比值和白细胞介素2(IL-2)表达水平,了解机体的免疫功能状态;检测肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)表达量,了解大鼠肝脏氧化损伤和抗自由基能力;HE染色观察大鼠肝脏病理学变化;免疫组化法检测肝癌标记物甲胎蛋白(AFP)及肝癌组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达;运用PCR及实时定量PCR技术,分别检测p53基因突变情况和c-myc、cyclinD1的表达量;记录各组大鼠的生存时间。 4.利用血清药理学方法制备扶正抗癌方、VC、扶正抗癌方与VC联用、UFT的大鼠含药血清,分别给予2.5%、5%、10%三个浓度的上述含药血清,应用CCK8法检测扶正抗癌方、VC、扶正抗癌方与VC联用、UFT含药血清培养不同时间(24h、48h、72h)对BRL细胞和CBRH7919细胞增殖的影响;选择对CBRH7919细胞有选择性杀伤作用的最佳含药血清浓度及血清孵育时间,运用流式细胞术进一步观察各组CBRH7919细胞周期及凋亡率的变化,并运用化学比色法检测各组CBRH7919细胞凋亡相关蛋白Caspase-3表达量的变化。 结果: 1.扶正抗癌方对大鼠Walker256移植性肝癌的抑制作用 1.1不同剂量的扶正抗癌方在不同时间段保肝护肝作用肝功能结果显示:与模型组比较,实验w1,中药高剂量组AST降低(P<0.05)。实验w2,低剂量组ALB、A/G升高(P<0.05),GGT降低(P<0.05),ALT、ALP显著降低(P<0.01);中剂量组ALB、A/G升高(P<0.05),ALT、ALP、GGT则显著降低(P<0.01);高剂量组ALB升高(P<0.05),A/G亦显著升高(P<0.01),ALT、ALP、GGT则显著低于模型组(P<0.01)。实验w3,中药低剂量组ALT、AST、GGT降低(P<0.05),ALP则显著降低(P<0.01);中剂量组ALB较模型组升高(P<0.05),ALT、AST、ALP、GGT显著降低(P<0.01);高剂量组A/G升高(P<0.05),ALB亦明显高于模型组(P<0.01),ALT、AST、ALP、GGT、AFU则显著降低(P<0.01)。 1.2不同剂量的扶正抗癌方在不同时间段的抑癌作用实验w1-w3,中药各剂量组均能抑制肿瘤生长,其中高剂量组于实验w3时的肿瘤重量抑制率高于低剂量组(P<0.05)。病理结果示,高剂量扶正抗癌方在肝癌早、中期(w1、w2)可抑制癌细胞向周围浸润,在肝癌晚期(w3)则能促进癌细胞坏死。实验w3,中药低、中、高剂量组肿瘤转移评分均低于模型组(P<0.05)。 1.3不同剂量的扶正抗癌方对大鼠生存时间的影响中药高剂量组大鼠的生存时间延长,与模型组比较有差异(P<0.05)。 2.维生素C对大鼠Walker256移植性肝癌的抑制作用 2.1维生素C的保肝护肝作用VC低剂量组血清A/G高于模型组(P<0.05),ALT明显低于模型组(P<0.01),GGT亦低于模型组(P<0.05);VC高剂量组血清ALT亦低于模型组(P<0.05)。 2.2维生素C的抑癌作用VC抑制肿瘤体积和重量的效果不明显(P>0.05),但病理结果显示VC可促进肿瘤细胞坏死,其中VC低剂量组肝癌的坏死程度高于模型组(P<0.05)。 3.扶正抗癌方、维生素C及两者联用对DEN诱发大鼠肝癌的防治作用 3.1不同时间段各组大鼠肝功能变化实验w8,中药组、VC组血清ALP较模型组降低(P<0.05),中药与VC联用不仅能显著降低ALP(P<0.01),还能抑制肝脏AST的释放,与模型组比较有差异(P<0.05)。实验w14,中药、VC以及两者联用保肝护肝的作用更明显,其中中药组ALT、AST显著低于模型组(P<0.01),中药还能抑制肝脏GGT的合成,含量较模型组降低(P<0.05);与模型组比较,VC组、中药+VC组ALT降低(P<0.05),AST显著降低(P<0.01),此外还可改善蛋白合成功能,其中VC组STP、GLB回升(P<0.05),中药+VC组作用更明显,STP、GLB显著高于模型组(P<0.01)。随着肝癌的进展,实验w20,中药仍能抑制肝脏释放AST,表达量低于模型组(P<0.05);中药+VC组AST显著低于模型组(P<0.01),且ALT亦低于模型组(P<0.05),化疗组各指标与模型组比较无差异(P>0.05)。 3.2不同时间段各组大鼠肝癌进展的比较病理结果显示中药、VC及两者联用可延缓癌变进展,在诱癌晚期还可以促进癌细胞坏死,UFT亦能促进癌细胞坏死。此外,w8,w14时,中药+VC组AFP低于模型组(P<0.05),w20时,中药+VC组AFP进一步降低,较模型组差异显著(P<0.01),且明显低于化疗组(P<0.05);此时中药+VC组大鼠的体重/肝重比值比模型组回升(P<0.05)。 3.3不同时间段各组大鼠免疫功能变化肝癌大鼠存在一定的细胞免疫障碍,表现为CD~(4+)/CD~(8+)比值减少,且免疫增强因子IL-2表达降低。实验w8,VC能使肝癌大鼠的CD~(4+)/CD~(8+)比值回升(P<0.05),中药、中药与VC联用的效果更明显,CD~(4+)/CD~(8+)比值显著高于模型组(P<0.01);w14时,中药+VC组CD~(4+)/CD~(8+)比值亦明显高于模型组(P<0.01);实验w20,与模型组比较,中药、中药与VC联用不仅能显著增加CD~(4+)/CD~(8+)比值(P<0.01),还能使血清IL-2表达增加(P<0.05)。 3.4不同时间段各组大鼠氧化损伤程度大鼠饮用DEN后,肝脏MDA表达量增加。给予药物治疗后,实验w8,VC组和中药+VC组MDA表达减少(P<0.05);实验w14,中药组SOD分泌增加(P<0.05),VC组和中药+VC组SOD显著增加(P<0.01);实验w20,中药组、VC组、中药+VC组、化疗组MDA均显著低于模型组(P<0.01),且中药组SOD、GSH-PX表达增加(P<0.05),VC、中药与VC联用增加SOD、GSH-PX的作用更明显,其表达量显著高于模型组(P<0.01)。 3.5不同时间段各组大鼠VEGF表达量变化免疫组化方法检测各组肝脏VEGF表达,结果显示,实验w8时VC组、中药+VC组VEGF表达量明显降低,与模型组比较有显著差异(P<0.01),中药组VEGF表达量亦下降(P<0.05);实验w14,中药组、VC组、中药+VC组均能显著抑制VEGF表达(P<0.01);在诱癌晚期(w20)中药+VC组VEGF不仅低于模型组(P<0.05),亦低于化疗组(P<0.05)。 3.6不同时间段各组大鼠p53突变率及c-myc、cyclinD1表达量DEN诱发的大鼠肝癌p53突变率高,并存在多处突变点,w14时,中药、VC、中药与VC联用均能减少其突变点(P<0.01);此外肝癌大鼠的c-myc、cyclinD1基因表达量随着癌变进展逐渐增加,中药、VC、中药与VC联用以及UFT均能减少c-myc、cyclinD1的表达,其中中药与VC联用效果最佳,在实验w20,中药+VC组c-myc、cyclinD1的表达量分别约为模型组的1/18、1/16。 3.7各组大鼠生存时间比较中药组和中药+VC组大鼠的生存时间较模型组延长(P<0.05),且中药+VC组大鼠生存时间长于化疗组(P<0.01),中药组大鼠生存时间亦长于化疗组(P<0.05)。 4.扶正抗癌方、维生素C及两者联用对大鼠肝癌细胞增殖、周期、凋亡的影响5%的中药组、VC组、中药+VC组、化疗组含药血清作用48h能选择性抑制CBRH7919细胞增殖,其中中药+VC组的作用显著优于中药组和化疗组(P<0.01)。中药组含药血清能使CBRH7919细胞G_1期比率高于空白血清对照组(P<0.01),使细胞增殖阻滞在G_1期;VC组、中药+VC组含药血清均能使CBRH7919细胞S期比率显著升高(P<0.01),化疗组含药血清亦能使CBRH7919细胞S期比率升高(P<0.05),使细胞增殖阻滞在S期。中药组、VC组、中药+VC组和化疗组含药血清使Caspase-3表达增加(P<0.05),并诱导CBRH7919细胞凋亡,中药+VC组、化疗组凋亡率较空白血清对照组显著升高(P<0.01),其效果优于中药组(P<0.01)和VC组(P<0.05)。 结论: 1.扶正抗癌方、VC及两者联用对大鼠肝癌有防治作用,主要表现在保护肝功能、抑制肝癌细胞的增殖、抑制肝癌的生长、抑制AFP表达、改善大鼠的带瘤生存状态及延长生存时间等方面。 2.扶正抗癌方与VC联用抑制肝癌细胞增殖并诱导其凋亡的效果优于扶正抗癌方、VC单用;与化疗药UFT相比,扶正抗癌方及扶正抗癌方与VC联用在延长大鼠带瘤生存时间方面效果更明显;此外,扶正抗癌方与VC联用能抑制肝脏AFP、VEGF表达,效果亦优于化疗药UFT。 3.扶正抗癌方、VC及两者联用防治肝癌的作用机制可能与以下几方面有关: 3.1提高血清CD~(4+)/CD~(8+)比值,增加IL-2的表达,从而增强机体的细胞免疫力; 3.2增强肝脏SOD、GSH-PX的活力,减少MDA的表达量,从而提高大鼠肝脏的抗自由基能力,减轻肝脏的氧化损伤; 3.3降低肝脏的VEGF表达量,进而抑制肝癌的血管生成; 3.4降低c-myc、cyclin D1的表达,阻滞肝癌细胞生长周期,抑制肝癌细胞的增殖; 3.5抑制抑癌基因p53的突变,增加Caspase-3表达,促进肝癌细胞凋亡。


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