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《暨南大学》 2009年
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肾小管上皮细胞损伤和LB膜缺陷调控下草酸钙的生物矿化

邓穗平  
【摘要】: 肾结石的形成是在体内的化学调控、细胞调控等多层次的复杂系统中进行的过程。本文在一系列不同层次的体外模拟体系,即在尿液、单分子膜、缺陷Langmuir-Blodgett(LB)膜、受损伤肾小管上皮细胞等体系中,较为系统地研究了肾结石矿物草酸钙(CaOxa)晶体的生物矿化过程,研究结果有助于在分子和超分子的水平上进一步了解肾上皮细胞膜损伤后诱导肾结石形成的分子机制,以期为抑制肾结石的形成提供新的启示。 1.在结石患者尿液和健康者尿液中,采用扫描电子显微镜(SEM)、X-射线衍射(XRD)、傅立叶变换红外光谱(FT-IR),比较研究了CaOxa晶体在上述两个体系中的结晶规律。在健康者尿液里,在结晶的早期阶段是晶体生长控制过程,在结晶的中晚期阶段则转为成核控制过程。然而,在结石患者尿液里总是晶体生长控制过程,即CaOxa晶粒的尺寸逐渐增加,最后将导致形成较大尺寸的尿结石。两种尿液里CaOxa的结晶存在三种差异:患者尿液里的晶体尺寸较大,而健康者尿液里的晶体尺寸较小;患者尿液里的一水草酸钙(COM)晶体形状较为尖锐,而健康者尿液里的晶体形状较为圆钝;健康者尿液里还形成了二水草酸钙(COD)晶体。上述结果为防治肾石症提供了重要的启示。 2.在硬脂酸(SA)单分子膜诱导下,研究了尿小分子柠檬酸钾(K3cit)和pH对不同表面压下膜诱导的COM晶体成核和生长的影响。在较低表面压如0.1、1 mN/m下,SA单分子膜更适配COM的生长,因而得到尺寸较大的COM晶体。K3cit抑制膜下COM晶体的生长,归因于柠檬酸根干扰了SA分子在膜/液界面的有序排列,使SA单分子膜不能和晶核形成较好的晶格匹配。pH的变化改变了柠檬酸根不同物种的分布情况,从而影响COM晶面的生长,且在pH为12时诱导了COD晶体的生长,归因于K3cit对COD的诱导作用和高pH条件下SA单分子膜/液界面高的Ca2+/Oxa2-摩尔比。 在二棕榈酰磷酯酰胆碱(DPPC)单分子膜诱导下,研究了尿大分子硫酸软骨素C(C6S)对膜下COM晶体的影响。C6S抑制COM晶体的生长、聚集,诱导COM晶体以((?)01)晶面择优生长,归因于带负电荷的C6S与DPPC亲水头基的带负电位点共同作用于富Ca2+离子的((?)01)晶面。 3.LB膜作为一种纳米级材料的应用因其存在的缺陷和不稳定性而受到限制。本文反其道而行之,创新性地利用DPPC的缺陷LB膜来模拟受损伤的肾上皮细胞膜诱导CaOxa晶体生长。采用原子力显微镜(AFM)、荧光显微镜、SEM、XRD研究了经不同浓度草酸钾处理后得到的缺陷LB膜微结构及其对COM晶体生长的影响。草酸钾的处理可进一步破坏LB膜圆形畴区内的分子列阵,尤其是使液态凝聚相(LC)和液态扩张相(LE)边界处的分子排列无序程度增加,导致形成圆形的缺陷畴区。这些缺陷畴区能够诱导COM晶体排列形成环状晶体图形。随着损伤LB膜的草酸钾浓度c(K2C2O4)从0.3 mmol/L增大至5.0mmol/L,其对LB膜畴区有序结构的破坏作用逐渐增强。当c(K2C2O4)为0.3 mmol/L时,缺陷LB膜诱导形成实心的圆形晶体图形,即晶体紧密排列在畴区内。当c(K2C2O4)增大至5.0 mmol/L时,晶体图形转变为空心的环状,即只在LC/LE边界才有晶体,且尺寸小于20μm的晶体图形数量显著增加。基片种类、温度、制膜参数等通过影响缺陷LB膜的结构,从而影响膜诱导形成的晶体图形。 4.在人肾小管上皮细胞(HKC)氧化损伤模型体系中,采用细胞增生分析试剂盒(CCK-8)法、SEM、激光共聚焦显微镜、倒置显微镜、Zeta电位分析仪等,观察HKC损伤前后的变化及其调控CaOxa过饱和溶液在其上的晶体成核、生长的差异。结果表明,(1)H2O2能明显地损伤HKC细胞,降低细胞存活率,且在H202浓度范围为0.3-0.5 mmol/L、作用时间为0.5~1.5 h内具有明显的剂量和时间依赖性。HKC损伤程度增加后,其诱导的晶体数量显著增加,但晶体尺寸增加不明显(P0.05),表明损伤细胞诱导肾石症形成可能是通过增加晶体的成核位点的方式进行。(2)正常的HKC细胞吞噬COD晶体的能力较强,且不引起明显的细胞损伤,表明正常的HKC细胞能够清除一定量的COD晶体。而受到氧化性损伤的细胞对晶体的吞噬能力减弱,且荧光显微镜观察结果表明损伤细胞表面表达晶体粘附分子骨桥蛋白(OPN),表明受损伤细胞可促进晶体滞留在肾小管内,有利于结石的形成。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R692.4

【参考文献】
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