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纳米金阻止VEGF165与VEGFR2结合的原子力显微镜研究

邱思远  
【摘要】: 目的:有研究表明纳米金(gold nanoparticle GNP)能阻止VEGF165与其受体VEGFR2的结合,从而抑制VEGF165介导的血管内皮细胞增殖。但对于具体的分子机制不甚了解。原子力显微镜(atomic force microscope AFM)技术可以从分子水平、可视化角度研究分子的相互作用。本实验利用这项技术,研究GNP、VEGF165和VEGFR2的相互作用,探讨GNP阻止VEGF165与VEGFR2结合的分子机制。 方法:1、3 ml浓度为0.15 nmol/L的GNP分别加入5 ng、10 ng、20ngVEGF165,4℃下静置孵育12h前后,用紫外可见光分光光度计检测其紫外可见光吸收光谱,粒径分析仪检测其粒径分布;将0.15 nmol/LGNP溶液100 ul与20 ng/ml VEGF165100 ul4℃下静置孵育12h后,与GNP对照组分别取5 ul滴于干净的云母片上自然晾干,用AFM表征,比较粒子大小和形貌。 2、3种不同浓度的GNP (5 nmol/L、2 nmol/L和0.5 nmol/L)各300μl,分别与100μl 0.02μg/ml的VEGF165在4℃下孵育过夜,与400μl 0.005μg/mlVEGF165分别作用于无血清培养的血管内皮细胞,24h后固定细胞,用AFM对血管内皮细胞表面超微结构进行成像。 3、用APTES/GA方法将VEGFR2固定于盖玻片上,分别与50μl,1μg/ml VEGF165、0.5 nm/ml GNP与2μg/ml VEGF165共育液、0.25 nm/ml GNP溶液4°C作用12h后,充分冲洗,晾干后,用AFM获得玻片上粒子图像,比较粒子大小、形貌的变化。 结果:1、GNP与VEGF165作用后,其吸收峰发生红移,表明溶液粒径增大;粒径分析表明GNP粒径的主要分布从20nm变成30nm;AFM表征GNP加入VEGF165前后形貌,测量其大小:单个GNP粒径22.05±1.52nm,呈椭圆形,边界清晰,加入VEGF165后,平均粒径变成33.91±2.61nm,边界模糊,形状不甚规则,表明GNP结合上VEGF165,并形成GNP-VEGF165核壳复合物。 2、在AFM成像下,VEGF165作用的血管内皮细胞出现伪足、细胞膜孔洞、细胞膜颗粒化和细胞连接增多等表现,GNP可以明显抑制这一现象,表明GNP抑制了VEGF165介导的血管内皮细胞增殖。 3、在修饰VEGFR2的玻片上,AFM获得VEGFR2单分子图像,平均直径80.10±9.13nm;与VEGF165作用后,出现平均长径246.17±14.84nm,短径150.10±8.84nm,椭圆形有突起的大分子粒子,表明了VEGFR2二聚体化,并发生结构变化;与GNP-VEGF165作用后,出现平均长径约182.89±6.81nm,短径约103.17±3.63nm粒子,其周围有大小约34.0nm的小粒子,表明了GNP-VEGF165与VEGFR2发生聚集,VEGFR2不能形成二聚体。 结论:1、GNP与VEGF165可以在近生理条件下通过化学键合作用形成“核-壳”复合物。 2.VEGF165刺激血管内皮细胞在超微结构上表现为伪足增多、细胞间接触增多、细胞表面颗粒化和细胞膜孔洞形成,GNP可以明显抑制VEGF165这一作用。 3、AFM可获得VEGFR2单分子形貌图,以及VEGF165与VEGFR2作用后的受体二聚体形貌图;GNP可以阻止VEGF165与VEGFR2的结合,使VEGFR2无法形成二聚体,阻断VEGF信号传导。 4、AFM可以以直观的方式研究生物分子相互作用,是研究分子生物学的有力工具。


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