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《暨南大学》 2010年
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两种细胞因子组合诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞分化的研究

朱华民  
【摘要】: 目的:本实验旨在探讨一种操作简单、费用低廉、结果可靠的人脐带间充质干细胞分离培养方法,为体外增殖提供一种可行的途径;对分离的人脐带间充质干细胞进行体外多细胞因子诱导,促使其向有功能的肝样细胞分化。 方法: 1、Ⅳ型胶原酶消化+差速贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞,进行体外传代,用流式细胞技术进行细胞表面抗原分析、细胞周期测定;作生长曲线;做功能鉴定(检测其成脂、成骨分化能力)。 2、选取培养第3代的脐带间充质干细胞,分4组培养:实验组(含HGF+EGF培养基组);对照组(含有HGF培养基组、含EGF培养基组、不加生长因子的DMEM/F12培养基对照组)。HGF (Hepatic growth factor)联合EGF(Epidermal growth factor)对体外培养的MSCs诱导分化,实验评估:用倒置相差显微镜、荧光显微镜、原子力显微镜做形态学观察;细胞免疫组化、免疫荧光、PAS糖原染色检测肝样细胞特异性抗原;RT-PCR检测肝样细胞特异性mRNA表达;采用溴甲酚绿法检测培养上清液中白蛋白(ALB)水平。 结果: 1、体外培养的原代MSCs24小时内可见贴壁细胞,3天左右达到汇合,传代后,表面标志表达:人脐带间充质干细胞表面不表达造血标志CD34,低表达内皮细胞标志CD106(17.1%),高表达CD29(β1-整合素)和基质受体CD44,阳性率分别为99.3%和99.6%,表明间充质干细胞是区别于人组织造血细胞的另一类细胞。细胞周期检测结果显示:第3代人脐带间充质干细胞92.2%处在G0/G1期,4.1%细胞处在G2期,3.7%处在S期,说明符合间充质干细胞生长特性。多向分化潜能:人脐带间充质干细胞在脂肪诱导分化液内培养三四天,胞浆中即可出现折光性很强的脂肪空泡,诱导10d左右细胞形态逐渐发生变化,由细长梭形变为矮胖梭形、椭圆形、圆形,油红O染色后胞浆中呈现红色颗粒,说明人脐带间充质干细胞在体外有向脂肪分化的能力;而未诱导的细胞无此变化。在向成骨分化的培养体系内培养4周后,细胞形态逐渐发生变化,由长梭形渐变为立方形,有聚集倾向,2周时细胞爬片经碱性磷酸酶染色后,立方形、多边形细胞的胞浆染成棕黑色;而未诱导的细胞无此变化。 2、HGF联合EGF对体外培养的MSCs进行诱导分化:倒置相差显微镜观察显示实验组诱导培养的MSCs逐渐向类肝细胞形态转变,由刚开始的梭型,变为椭圆型、类圆形,增殖速度减慢,而对照组细胞的形态基本不变。细胞免疫组化、免疫荧光鉴定实验组细胞10天可检测到ALB、AFP、CK18表达,对照组在以上时间点未检测到上述指标。RT-PCR结果显示诱导第1Od,AFP,ALB的mRNA均呈阳性表达;诱导第20d,ALB仍为阳性表达,而AFP则不表达;空白对照组AFP、ALB始终不表达,反映了肝样细胞的形成和成熟过程。ELISA检实验组测培养上清液中清蛋白含量在诱导组4、8、12、16 d上清液中清蛋白的含量呈时间依赖性增加。对照组间充质干细胞没有分泌清蛋白。 结论:人脐带中含有丰富的间充质干细胞,其具有较强的多向分化潜能,经肝细胞生长因子与表皮生长因子联合诱导后,易向肝样细胞分化,具有肝样细胞部分功能。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R329

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【引证文献】
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